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植物染色体制片

2019.4.22

实验概要

掌握染色体制片方法，并自选材料进行染色体制片；学会染色体核型分析。

主要试剂

酒精、冰醋酸、甲醇、盐酸、铁矾、苏木精（或洋红、石炭酸品红）、秋水仙碱（或对二氯苯饱和水溶液、8-羟基奎啉、富民隆乳剂）、二甲苯、中性树胶、石碳酸、甲醛、山梨醇等。

主要设备

显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、吸水纸、纱布块、解剖针、剪刀、解剖刀、玻璃棒、铅笔、恒温水浴锅、温度计、冰箱、恒温干燥箱、显微摄影系统、照片打印纸。

实验步骤

1. 压片法

在生物技术上，除用切片法观察细胞外，还可用压片法，尤其是观察细胞中的染色体数目，用压片法最为合适，不仅省事，结果也比切片法好。压片法是将材料置载玻片上，用解剖刀或解剖针拨开，加染液一滴，盖以盖玻片，施以压力，使材料破碎，细胞分散，然后进行观察。压片法种类很多，下面介绍两种：

(1). 醋酸——洋红法

此法多用于制备幼小花药，观察花粉母细胞减数分裂的压片。而对根尖压片有时染色不好(但对洋葱根尖染色较好)。其步骤如下：

a. 将花药或根尖(先切成0.5cm长)，投入卡诺氏固定液中固定1刻钟至l小时，然后移至70％酒精中保存。

b. 取固定保存的材料放入盐酸酒精解离液(95％酒精一份，浓盐酸一份，将二者混合即成)中5～8分钟。或置1N盐酸(取比重1.19的盐酸82.5毫升，加水至1000毫升即成)中于60℃的水浴温度下，处理6～8分钟，至透明为止。

c. 用清水冲洗干净解离液。

d. 取洗净的材料，放在载玻片上，用醋酸洋红染液(或醋酸苏木精染液)染色5～10分钟。

e. 然后将材料移至另一清洁的载玻片上。重新用染液装片，覆以盖玻片，以铅笔的橡皮头端轻轻压盖玻片，使材料呈现分散的薄层，置镜下观察。

(2). 铁矾——苏木精法

此法一般用于细胞有丝分裂中的染色体计数，由于染色体被染成紫兰黑色，用于显微照相，效果较好。（由于各种植物有自己的特殊性，因此，取材的时间、取材的部位、预处理的时间、固定的时问、水解的时间、染色的时间等，都有可能不同。在此只作了大致的介绍，具体材料还需作预备实验进行摸索。另外还要注意，各次水洗一定要洗干净沾在材料上的药液，以免影响下一个步骤的结果。）染色步骤如下(以蚕豆根尖作材料为例)：

a. 取材：将蚕豆种子萌发。待种子根长至1cm左右，在上午8时～11时之间，切下长约0.5cm的根尖，进行预处理。

b. 预处理：目的使分裂细胞的染色体缩短和比较分散，便于压片观察。预处理是在固定以前进行，方法是将材料切下放入以下溶液：

0.05～0.2％秋水仙碱水溶液中处理2～5小时；

或：对二氯苯饱和水溶液中处理3-5小时；

或：8-羟基奎啉(0.004～0.005％)，处理2～12小时；

或：富民隆乳剂(0.01％)，处理24～48小时；

或：在0～3℃下冷冻处理24小时。

c. 固定：通常用95％酒精—冰醋酸(3：1)固定液固定1～24小时。固定后换入70％酒精中保存。一般可保存1～2星期，如放入冰箱中(3～8℃)则可保存数月。 (4) 离析：将保存在70％酒精中的根尖，用刀纵切成两半，换入蒸馏水，然后移入1N盐酸中，在60℃的水浴中离析10～15分钟。

d. 水洗：离析后必须用水洗净残留盐酸，否则会影响染色。

e. 媒染：将根尖移入4％铁矾水溶液中，媒染20～30分钟，然后用水洗净。

f. 染色：放入0.5％苏木精水溶液染色3～5小时，如果需要染色较久(例如过夜)则可将苏木精溶液浓度稀释。

g. 压片：用镊子夹取根尖一段，放在载玻片上，滴上一小滴醋酸，迅速捣碎根尖，盖上盖玻片，用铅笔的橡皮头轻压，使材料分散成一薄层。

h. 镜检：将材料压好后，放置显微镜下观察。

若要作永久保存，可将玻片放在电冰箱中冷冻，结了冰霜后便可揭下盖玻片，然后将沾有材料的玻片分别与另外干净的盖玻片和载玻片进行封片处理，制作永久玻片。

也可按以下步骤制成永久制片：

a. 将压片直接倒放在盛有1/2 45％醋酸 1/2 95％酒精的培养皿中，并使玻片稍成倾斜(一边可垫上一玻棒)。待过5～10分钟，即可见盖玻片从载玻片上脱落下来，此时即按原来位置翻开。

b. 将已分开的载玻片与盖玻片，用吸水纸吸去边去多余的醋酸液，换入冰醋酸无水酒精(1：1)中，3分钟。

c. 将载玻片与盖玻片移入无水酒精中(二次)，每次3分钟。

d. 移入无水酒精二甲苯(1：1)，3分钟。

e. 移入二甲苯(二次)，各3分钟。

f. 用加拿大树胶按原来的位置封藏玻片。

g. 移入温箱烘干(20～30℃)，3小时，即得永久制片。

2. 酶法(略)

附：改良石炭酸品红染色液配制法：取3克碱性品红，溶于100毫升70％酒精中(可无限期保存)；取10毫升此溶液加入90毫升5％石灰酸水溶液(两周内用有效)；取此溶液55毫升，加入冰醋酸和37％甲醛各6毫升；取此混合液2～10毫升加入90～98毫升45％醋酸和1.8克山梨醇。这样便配制成了染色液，此液放置越久后越好使用。

3. 染色体计数与核型分析

首先，计数体细胞染色体数目，统计的细胞数目在30个以上。然后，以体细胞分裂中期的具有高质量的染色体图像作为形态描述，应以5个以上的细胞为准，测量的内容有：绝对长度=放大的染色体长度÷放大倍数(单位以微米表示)。相对长度=染色体长度÷染色体组总长度×100％，相对长度系数：染色体长度/全组染色体平均长度，染色体长度比：最长染色体长度/最短染色体长度，核型不对称系数=长臂总长/全组染色体总长，臂比=长臂长度/短臂长度，差值=长臂长度—短臂长度，着丝点指数，等等。另外，还要确定染色体长度类型、着丝点位置，绘制核型分析结果表、核型图、核型模式图，摄制模式照片，写出核型公式，划分核型类型，等等。最后，根据各项数据、结果进行讨论分析。

附：

(1). 染色体长度类型确定

相对长度系数值长度类型符号记为

≥1.26 长染色体 L

1.25～1.01 中长染色体 M2

1.00～0.76 中短染色体 Ml

≤0.75 短染色体 S

(2). 着丝点位置确定

臂比值着丝点位置符号记为

1.00 正中部着丝点 M

1.01～1.70 中部着丝点区 m

l.71～3.00 近中部着丝点区 sm