基因型鉴定试剂盒使用说明
试剂盒成分
1、 YSY Buffer
2、2*PCR Master Mix（使用实验室常用的酶即可，由客户自备）
储藏条件：4oC
实验步骤
1、细胞与动物组织的准备：
1.1 培养细胞准备：
以培养密度为 1´106 个/ml 为例，在超净台内取 1ml（内含 300-1000 个细胞）；对于某些类贴壁细
胞，可直接刮取侧壁细胞，植入已编号的 PCR 管内。
血液准备：
取适当部位，采集血液 1 ml。
注意：如果样品在 10 分钟内处理，则无需抗凝处理；在高通量采样情况下，如果样品在塑料PCR管内需存放 10 分钟以上，需采用抗凝处理。
1.3 哺乳动物组织准备：
采集相应部位，剪取 1mm3（1 ml）左右组织放入已编号的 PCR 管内。
1.4 斑马鱼尾鳍、果蝇等其他模式动物组织准备：
选取尾鳍、翅膀等无损害部位，可通过剪取、穿孔或针刺等方法制备少量新鲜组织，体积约 1mm3
即 1 ml。
2、基因组 DNA 模板的制备
加样
10ml 的 YSYBuffer 液分别逐一加入装有组织或细胞的 PCR 管壁（注意勿将枪头碰到组织
YSY Biotech 基因的故事 让斑马鱼来为您讲述
样品，防止污染）；加样完毕后，将 PCR 管快速离心，确保溶液和组织或细胞均位于 PCR 管
底部；
制备基因组模板
PCR 管放入 PCR 仪中，启动 PCR 程序：65℃×30min、95℃×5min、16℃×1min。基因组
模板若不立即使用，请放入-20℃保存。
3、目标基因的 PCR 扩增（以下试剂请自备）
3.1 取用新的 PCR 管，按下列顺序组装 PCR 反应体系：
20 ml 反应体系（产物直接凝胶电泳进行基因型鉴定用）
基因组 DNA 模板（步骤 2.2 所得）：1 ml
2 × PCR Master Mix：10 ml（自备）
正向引物（5mM）： 1ml （自备）
反向引物（5mM）： 1ml （自备）
超纯水： 7 ml（自备）
组装完毕后，将 PCR 管快速离心，确保所有溶液均位于 PCR 管底部；
将 PCR 管放入 PCR 仪中，启动客户自行设计的 PCR 程序完成 PCR 扩增。
4、PCR 产物验证
取 2ml 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定；若需进一步测序，可将余下的产物直接送测
序；若需酶切鉴定，则在经 PCR 产物纯化试剂盒纯化后，用核酸酶内切酶进行酶切鉴定。
注：测序公司一般额外收取 5 元钱的切胶费用，请在送测前和测序公司确认无需切胶回收。
5、结果阅读（基因突变及突变率分析）
如果基因型可由引物特异性识别，则通过将观测 PCR 产物电泳结果确定基因型；通过测序确定基
因型的，其测序结果可通过人工阅读测序的色谱图，识别突变等位基因的基因型，确定突变率。核
酸内切酶酶切结果可通过对凝胶电泳条带的灰度分析，确定突变率。
