方案6 MALDI-MS确定酪氨酸磷酸化位点实验
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、SDS-PAGE 分离的 Gab-I 蛋白的消化1.把通过自显影确定的含有磷酸化蛋白的条带切下来。 2.将凝胶切成 1mm2 的条带,把它们放到检测管中。 用特定的不含 Na+、K+的试管消化,否则 Na+、K+的化合物会在 MS 中出现。 3.用消化缓冲液 A 洗凝胶条,37°C,lOmin。 4.用消化缓冲液 B 洗凝胶条,37°C,lOmin。 5.重复③、④步两次以上。 6.室温下加乙腈使凝胶条带脱水,直到胶条变白(约 3 min)。 7.加蛋白酶溶液,37°C,20 min,使凝胶膨胀。 酶解温度取决于所用的蛋白酶(例如,Glu-C 需要在 25°C,而胰蛋白酶需要在 37°C)。 8.在凝胶块上加消化缓冲液 A 防止其干燥,37°C 下孵育过夜。 二、用于阴离子交换色谱的凝胶条带的抽提9.加 20ul 消化缓冲液 A 到凝胶中,4°C 下超声 20 min。 10.收集上清。 11.重复⑨、⑩步两次以上。 三、阴离子交换色谱12.调整阴离子交换柱的流速为0.5 ml/min。 13.把合并的上清液,加到柱子上。 14.用离子交换缓冲液 A 洗柱子 20 min。 15.用呈现 0~10% 的梯度离子交换缓冲液 B,从柱子上洗脱多肽,持续 40 min,在洗脱过程中每分钟收集0.5 ml 的洗脱液。 16.提高离子交换缓冲液 B 的梯度,即 10%~50%,持续 75 min。 17.用 Cerenkov 计数器测量每一组分的放射性,或测量经闪烁放大的每一组分的放射性。 18.按每一部分的相对放射性对洗脱时间作图(例子见图 9.14)。 四、对有放射性的洗脱液作 RP-HPLC 色谱分析19.从阴离子交换色谱洗脱液中选一个具有放射性的组分。 20.用一个离心干燥器将其体积由 500ul 减小到 80ul。 21.调整 M-HPLC 柱的流速到 704/min。 22.用一个死体积 T-分流器调整 y-HPLC 柱子的流速到 16ul/min。 23.把样品加到一个 80ul 的进样环管中。 24.用 95% 的 pRP-HPLC 缓冲液 A 洗柱子 30 min。 25.UV 检测器调零,光度计的采样频率设为 2 Hz,在 215nm 和 295nm 下对 RP-HPLC 洗脱液进行 UV 检测。 26.用 5%~50% 的梯度 JLtRP-HPLC 缓冲液 B 洗脱,持续 90 min。 27.收集洗脱液,使每一组分的体积为 8~16ul。 28.从每一组分中取 0.5ul 转移到小瓶中进行放射性的测量。 组分的体积依赖于峰的大小 29.将这些组分在-70°C 下迅速冷却,图 9.15 显示了一个典型的 RP-HPLC 色谱图。 五、对于放射性的组分作 MALDI-MS 分析30.从 RP-HPLC 中选一个具有放射性的组分,把0.3ul 的收集液加到不锈钢的 MALDI 板上。 31.加 0.3ul 的基质溶液到样品上,空气中自然干燥(约 1 min)。 32.以线性或反射的模式记录 MALDI 谱图(见图 9.16)。 33.把从 MALDI-MS 谱图中获得的理论计算(inSilic0) 的多肽质量与理论消化憐酸化蛋白(如 GPMAW,Protein-Prospector) 所获得的实验性质量进行比较。要考虑以下几个方面: (1)甲硫氨酸的氧化; (2)氨基端的乙酰化; (3)S、T、Y 的磷酸化(本实例中是 Y 的磷酸化); (4)XXRQXX 和 XXKQXX 上焦谷氨酸的产生; (5)不完全消化。 34.选择可能的鱗酸化多肽做 MALDI-PSD 分析。图 9.17 和图 9.18 显示了磷酸化酪氨酸多肽的 4 种不同 MALDI-PSD 谱图。图 9.19 中显示了多肽一般的片段化模式。 |