彗星试验原理及注意事项（二）
样本制备：
在最后一次用测试化学品后的适当时间，对动物实施安乐死。收集选定的组织,而同时采集同一组织的一部分,放置在甲醛溶液或适当的固定剂可能组织病理学分析。彗星实验的组织被放置在切碎缓冲液中，用冷切碎缓冲液充分冲洗以去除残留的血液，并储存在冰冷的切碎缓冲液中，直到处理完毕。原位灌注也可进行，如肝、肾灌注。
玻片准备：单细胞悬液制备后，应尽快(最好在1小时内)制备载玻片，但动物死亡与载玻片制备之间的温度和时间应严格控制，并在实验室条件下进行验证。向低熔点琼脂糖(通常0.5-1.0%)中加入细胞悬浮液的体积，使玻片的低熔点琼脂糖百分比不应降低到0.45%以下。最佳的细胞密度将由用来给彗星评分的图像分析系统决定。
细胞裂解：裂解条件也是一个关键变量，可能会干扰特定类型的DNA修饰(某些DNA烷基化和碱基内收)导致的链断裂。因此，我们建议在实验中对所有玻片的裂解条件尽可能保持恒定。准备好后，应在约2-8摄氏度的弱光条件下(如黄光(或防光)，将载玻片浸入冷冻溶解液中至少1小时(或过夜)，以避免暴露在可能含有紫外线成分的白光下。在此潜伏期之后，在碱液展开步骤之前，应冲洗载玻片以除去残留的洗涤剂和盐。这可以用纯净水、中和缓冲液或磷酸盐缓冲液来完成。也可以使用电泳缓冲液。这将维持电泳室的碱性条件。
解旋和电泳：将载玻片随机放置在含有足够电泳溶液的潜电泳装置的平台上，使载玻片表面完全覆盖(每次覆盖的深度也应一致)。在其他类型的彗星试验电泳装置，即主动冷却，循环和高容量电源，较高的解决方案覆盖将导致更高的电流，而电压保持不变。在电泳槽内放置载玻片应采用平衡设计，以减轻槽内任何趋势或边缘效应的影响，并尽量减少批与批之间的差异，即，在每次电泳中，研究中每个动物的载玻片数量应相同，并应包括来自不同剂量组(阴性和阳性对照)的样本。应该留给DNA解旋至少20分钟,然后进行电泳受控条件下,测定的灵敏度和动态范围最大化(即导致尾部DNA百分比的可接受水平的正面和负面的控制灵敏度最大化)。DNA迁移水平与电泳时间线性相关，也与电位(V/cm)线性相关。根据JaCVAM试验，这可能是0.7
V/cm，持续至少20分钟。电泳时间被认为是一个关键的变量，需要设置电泳时间来优化动态范围。较长的电泳时间(如30或40分钟，以提高灵敏度)通常会导致较强的阳性反应已知的诱变。然而，较长的电泳时间也可能导致过度迁移的控制样本。在每个实验中，电压应保持恒定，其他参数的变异性应在一个较窄的指定范围内。调节缓冲深度，达到要求，并在整个实验过程中保持。应记录电泳开始和结束时的电流。因此，最佳条件应在实验室中与所研究的每个组织有关的熟练程度的初步演示期间确定。通过展开和电泳的电泳溶液的温度应保持在低温下，通常为2-10oC(10)。
电泳完成后，将载玻片在中和缓冲液中浸泡/冲洗至少5分钟。凝胶可以被染色并标记为“新鲜”(例如在1-2天内)，也可以被脱水以便以后的标记(例如在染色后1-2周内)。但是，这些条件应该在熟练程度的展示过程中得到验证，并且应该为每个条件分别获得和保留历史数据。如果是后者，则应将玻片浸入无水乙醇中脱水至少5分钟，风干，然后储存在室温或冰箱容器中。
测量方法：彗星应该使用自动化或半自动化的图像分析系统进行定量评分。用合适的荧光染色剂对载玻片进行染色，并在配备有超荧光和适当检测器的显微镜或数码相机上进行适当放大(如200x)的测量。
根据彗星图像图谱的描述，细胞可以分为三种类型，即可分析、不可分析和“刺猬。只有可分析的细胞(明确定义的头部和尾部，不干扰相邻的细胞)应该为%的尾部DNA，以避免人为干扰。刺猬的频率应该根据每个样本至少150个细胞的视觉评分(因为缺少一个清晰定义的头部意味着它们不容易被图像分析检测到)来确定，并单独记录下来。
所有用于分析的玻片，包括阳性和阴性对照的玻片，都应独立编码并进行“盲法”评分，以便评分者不知道情况。对于每个样本(每个动物的每个组织)，至少应该分析150个细胞(刺猬除外)。分析150细胞/动物至少5动物每剂，提供足够的统计能力。
彗星DNA链断裂可以通过尾DNA %、尾长和尾力矩等独立端点来测量。如果使用适当的图像软件分析仪系统，就可以进行这三种测量。然而，推荐将%尾DNA(也称为%尾强度)用于结果的评估和解释，并由以细胞总强度百分比表示的尾DNA片段强度决定。
数据处理和结果判断
在实验条件下，阳性对照组的尾DNA%的与阴性对照相比具有统计学意义上的增加（p<0.05）时，判定试验系统有效。
在试验系统判定有效的前提下，同时满足以下三个条件，则判定受试样品为阳性结果：
（1） 尾DNA%的在某个单独剂量组显著升高；
（2） 尾DNA%随试验样品浓度升高有显著增加趋势；
（3） 受试物组的尾DNA%全部超过阴性背景数据范围。
在判定阳性结果时，如仅符合上述标准中的一个或两个，除统计学意义外，还应考虑其生物学意义。
如全部不符合上述3个，则判定为阴性结果。
试验报告
试验报告应包括以下内容：
（1）受试物来源如批号；
（2）测试化学品的稳定性、使用限制日期或已知的重新分析日期;
（3）化学识别，如IUPAC或CAS名称、CAS编号、SMILES或InChI代码、结构公式、纯度、杂质的化学识别(视情况和实际可行)等。
（4）多组分物质，UVBCs和混合物, 尽可能用化学特性(见上文)、定量发生和表征化学成分的相关理化性质。
（5）溶剂选择的理由，已知测试化学品在溶剂/溶媒中的溶解性和稳定性;剂量制剂的制备;对配方(例如稳定性、均匀性、名义浓度)的分析测定;
（6）实验动物：所使用的品种，以及作出选择的科学和伦理理由;动物的数目、年龄和性别;来源、居住条件、饮食、营养等;试验开始和结束时动物的体重，包括每组动物体重的范围、平均值和标准差;
（7）测试条件：阳性和阴性控制数据;测距研究的结果(如进行);剂量水平选择的理由;测试化学制剂的详细资料;测试化学品的管理详情;行政路线的基本原理;注射部位(用于皮下或静脉注射研究);样品制备方法，如有，组织病理学分析，特别是对彗星反应阳性的物质;
（8组织选择的基本原理;
如果检测结果为阴性，则验证该测试化学品是否达到目标组织或一般循环的方法;
根据膳食/饮用水试验化学浓度(ppm)和消耗量(如适用)计算的实际剂量(mg/kg体重/日);
饮食及水质详情;详细说明实验方案和取样计划以及选择的理由(如有毒物动力学数据);-止痛、镇痛方法;-安乐死的方法;分离和保存组织的程序;制备单细胞悬液的方法;所有试剂的来源和批号(如有可能);评价细胞毒性的方法;电泳条件;使用染色技术；评价和测量彗星的方法;
（9）结果:对每只动物在试验前和整个试验期间进行一般临床观察(如有);进行细胞毒性试验的证据;超过一周的研究:研究期间的个体体重，包括各组体重范围、平均值和标准差;
剂量-反应关系明显;对于每个组织/动物，%的尾部DNA(或其他测量方法，如果选择)和每张玻片的中位数，每只动物的平均值和每组的平均值;同步和历史阴性对照数据，包括评估的每个组织的范围、平均值/中位数和标准差;并发和历史正控制数据;对于肝脏以外的组织，使用阳性对照的剂量-反应曲线。
（10）应用的统计分析和方法;
（11）讨论结果和结论
