提取蛋白质或酶的时候，为什么要在低温条件下操作
蛋白质提取方法-------列举10种方法一、植物组织蛋白质提取方法(summer)1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入)，准备提取液放在冰上。2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃4、提取上清夜，样品制备完成。蛋白质提取液：300ml1、1Mtris-HCl(PH8)45ml2、甘油(Glycerol)75ml3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！二、植物组织蛋白质提取方法(summer)三氯醋酸—丙酮沉淀法1、在液氮中研磨叶片2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉淀，备用。4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！三、组织：肠黏膜(newinbio)目的：WESTERNBLOT检测凋亡相关蛋白的表达应用TRIPURE提取蛋白质步骤：含蛋白质上清液中加入异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量)倒转混匀，置室温10min离心：12000g，10min，4度，弃上清加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE用量)振荡，置室温20min离心：7500g，5min，4度，弃上清重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次沉淀中加入100％乙醇2ml充分振荡混匀，置室温20min离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀1％SDS溶解沉淀离心：10000g，10min，4度取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。四、lysissolution:(yog)Proteinextractionbuffer(Camiolobuffer):100ml=(0.075MPotassiumAcetate)0.736g(0.3M)NaCl1.753g(0.1M)L-argininebasicsalt1.742g(0.01M)EDTA-HCl0.292g(0.25%)TritonX-100250.ulupto100mlwithdH20.pH7.4.Then0.2umfilter.1.Freezetissueinliquidnitrogen.2.RinseinPBSthenmince.3.Add1mlCamioloextractionbufferper100mgoftissue.4.Homogenizefor1minuteat4\\'C.5.Spinat3,000.rpm/15minutes/4\\'C.6.Removesupernatantandsaveinanothertube.7.Ifnecessary,dializethesupernatantagainstPBSwith50mM/LTris-HClpH7.4.五、植物材料：水稻苗，叶鞘，根(ynibcas)1、200毫克样品置于冰上磨碎2、加lysisbuffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清3、重复离心5minlysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40六、蛋白质样品制备(sigma)秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸(丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000r/min离心15min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，(有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。按每mg干粉加入20μl(可调)UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度(温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰)16000r/min离心15min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存七、植物根中蛋白质的抽取(phenol)(1)sample,液氮研磨(2)装1.5mlcentrifuge用tube(3)加1MKH2PO4+K2HPO4700ul(4)12000rpm,4度,10-15minite(5)取上层液，蛋白质就在里面八、SDSextractionfollowedbyacetoneprecipitation–simpleextractionprotocolthatdoesnotrequirephenol.Recommendedstartprotocolforwholetissueextractions.(hgp)1.Grind1goffreshtissuetoapowderwithliquidnitrogeninamortarandpestle.2.Add5mLofextractionmedia(0.175MTris-HCl,pH8.8,5%SDS,15%glycerol,0.3MDTT)directlytomortarandcontinuegrindingforanadditional30sec.3.Filterhomogenatethroughtwolayersofmiraclothintoa50mLFalcontubeatroomtemperature.4.Immediatelyadd4volumesoficecold100%acetonetofilteredhomogenate,mixbyvortexingandplaceat-20Cforatleastonehourtoprecipitateproteins.5.Centrifugeat5000gfor15mintocollectprecipitatedprotein,decantsupernatant.6.GentlyblotresidualacetonefromcontainerwithKimwipeandthenwashpelletin15-20mLofcold80%acetone.Besuretothoroughlybreak-uppelletbypipetting,vortexingorsonication.7.Repeatsteps5and6.8.Collectfinalproteinprecipitatebycentrifugationat5000gfor15minanddrypelletbyinvertingonKimwipefor15minat37C.9.Resuspendfinalpelletin0.5-1mLofIEFextractionsolution(8Murea,2Mthiourea,2%CHAPS,2%TritonX-100,50mMDTT,0.2%pH3-10ampholytes)bypipettingandvortexingat25-30C.Incubatesamplefor1hatroomtemperaturewithagitation.Donotheatsampleunderanycircumstancesasthiswillleadtocarbamylationofproteins.10.Centrifugefor10minat12000gandusesupernatanttorehydrateIPGstrips.11.Ifproteinquantitationisnecessary,precipitateproteinsamplewithTCAoracetonepriortoperformingBradfordorLowryassayasdetergentsandreducingagentsinterferewiththeseassays.Phenolextractionfollowedbymethanolicammoniumacetateprecipitation–aneffectiveprotocolforsamplepreparationfromprotein-poor,recalcitranttissuessuchasplants(seeHurkmanandTanaka,1986,PlantPhysiology81:802-80九、材料：细菌蛋白(puc18)用甲醇提取的，冻干后用缓冲液溶解的。样品缓冲液是一般的。其中含又2%的SDS，20mmol的2-巯基乙醇。十、线粒体蛋白的提取(bioon)IsolationforMitochondriaModificationbyBioonMaterialsandreagents:homogenizingbuffer:100mMmannitol10mMTris-HClbuffer(pH7.5)5mMMgCl2关于蛋白质1mMEGTA1mMDTTleupeptin(0.1ug/ml)0.1MNa2CO3Methods:-10*6Cellswerewashedwithice-coldPBSandlysedbyhomogenizingin1mlbuffer(ice-cold)containing100mMmannitol,10mMTris,5mMMgCl2,1mMEGTA,1mMDTT,leupeptin(0.1ug/ml)-SubjectedtoPolytronhomogenizationforthree-fourburstsof3-10seachatasettingof6.5.-Intactcellsandnucleiwereseparatedbycentrifugationat120gfor5minat4℃-Supernatantswerecentrifugedat10,000gfor10mintocollecttheheavy(mitochondrial)membranepellet.-Cytoplasmicfractionswereobtainedbycentrifugingsupernatantsat100,000gfor30min.-Resuspendedpelletto0.25mg/mlinfreshpreparationof0.1MNa2CO3(pH11.5)-Incubatedonicefor30min.-Ultracentrifugationat100000gfor1hat4℃toprecipitatethemitochondriamembraneprotein.Andthesupernatantsaremitochondrialmatrix.0.5mgofproteinsinmitochondriacanget100ugofproteins(thealkali-resistantfractions)Ref.:PNAS,2002，99：12825–12830本方法只适用于提大鼠细胞线粒体蛋白，而不适用于线粒体功能检测
