端粒酶活性TRAP实时定量检测试剂盒
主要用途
端粒酶活性TRAP实时定量检测试剂是一种旨在运用SYBR绿色荧光染料作为标记信号，结合端粒重复序列扩增方法（TRAP），既方便、快速地进行各种DNA模板的扩增，又实时检测和定量分析扩增产物，即端粒酶活性的经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。广泛应用于肿瘤、衰老等研究。产品即到即用，性能稳定，无核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量准确，重复性强，效果满意，质量保证。
技术背景
端粒酶（telomerase）是一种核糖核蛋白酶（ribonuleoprotein），与人体细胞永生化（immortalization）和转化（transformation）有关。端粒重复序列扩增方法（telomeric repeat amplification protocol；TRAP）是基于多聚酶联扩增的敏感高效的体外端粒酶活性的检测技术。首先，非端粒单核苷酸引物作为端粒酶的底物而持续延长产生六碱基差异的片段；然后，延长所获得的产物在非端粒单核苷酸引物和逆向引物的参与下进行特异性扩增。SYBR绿色荧光染料，作为DNA结合染料，可以和扩增子（amplican）上双链DNA的任一小沟（minor groove）结合，而发出荧光信号。根据每一循环的荧光强度来确定扩增产物的产量，并用循环阈值（threshold cycle；Ct）表示。TRAP实时定量PCR技术十倍敏感于常用TRAP电泳技术，同时避免二聚体产生的假阳性干扰。
产品内容
裂解液（Reagent A） 毫升
反应液（Reagent B） 微升
染色液（Reagent C） 微升
补充液（Reagent D） 毫升
封隔液（Reagent E） 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；染色液（Reagent C）避免光照，有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
微型台式离心机：用于样品沉淀收集
PCR管：用于样品扩增操作的容器
荧光定量PCR仪：用于荧光定量PCR反应
实验提示
样品制备
1）细胞样品制备
准备1个细胞培养6孔板的单孔细胞，直至生长至80％铺满率（1 X 105细胞）
小心抽去细胞培养液
用细胞刮脱棒刮落细胞转移到1.5毫升离心管
放进微型台式离心机离心5分钟，速度为3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
小心抽去上清液
小心加入xx微升预冷的裂解液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
放进冰槽里孵育30分钟
（选择步骤）放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
（选择步骤）小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
移取5微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
即刻放进－70℃冰箱里保存或置于冰槽里备用
2）组织样品制备
手术取出动物组织，并秤取50毫克待测组织
移入到一个液氮冻存管
即刻放进液氮罐过夜
次日从液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
放进DOUNCE 匀浆器
加入xx微升预冷的裂解液（Reagent A）
匀化80下
小心转移到1.5毫升离心管
放进冰槽里孵育30分钟
即刻放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g （或13000RPM，例如eppendorf 5415）
小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
移取5微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
定量检测
一次反应总量为25微升
移取xx微升反应液（Reagent B）到0.5毫升PCR管
加入1微升待测的细胞或组织裂解悬液（总量为250纳克总蛋白；注意：严格避免RNA酶污染）
加入xx微升染色液（Reagent C）
加入xx微升补充液（Reagent D）到总量25微升
放进4℃微型台式离心机瞬时离心5秒
使用xx微升枪头加入1滴封隔液（Reagent E）（注意：参见注意事项9）
即刻放进荧光定量PCR仪
荧光定量PCR反应程序为：
采集数据，进行溶解曲线分析
PCR产物置于－20℃保存备用
注意事项
本产品为20次PCR反应
操作时，须戴手套
本产品适合各种荧光定量PCR仪
建议整个操作在4℃下进行
必须使用带滤芯的枪头
所有器皿、离心管、液体等无RNA酶污染
使用时，避免污染母液
建议使用裂解液或无离子水作为阴性对照
根据用户PCR仪的性能，决定是否加入封隔液（Reagent E）
配制完成后，即刻进行扩增反应，以确保反应物的活性
试剂避免反复冻融
通常样品量范围为1.6纳克至1微克；理想范围为250纳克；如果没有反应，可能样品中存在PCR抑制剂，建议调整样品量为100至200纳克
PCR扩增反应的最初3个循环为定量基线；3至15个循环的荧光信号的10倍值为荧光阈值；荧光信号达到阈值所需的循环数为Ct值（参考图像如下）：其中6号为阴性对照
Ct值作为端粒酶活性的计量单位
用户可以使用293细胞（10，100，和1000细胞数）作为阳性对照，以此建立标准曲线：横座标（X轴）为细胞量对数，纵座标（Y轴）为Ct值
如果检测卵细胞样品，建议平均每个卵细胞使用5微升裂解液（Reagent A）裂解细胞，孵育60分钟，取1/10至1/20的卵细胞量，进行定量扩增反应
