感受态制备:农杆菌感受态细胞制备实验
农杆菌感受态细胞制备实验
农杆菌感受态细胞制备可以:(1)用于建立农杆菌转化体系;(2)用于农杆菌表达系统构建;(3)用于农杆菌其他分子生物学研究。
实验方法
氯化钙法
电转农杆菌感受态
实验方法原理 | 在基因工程操作中,感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中,0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变,此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | 超净工作台 恒温摇床 冷冻高速离心机 高压灭菌锅 冰箱 超低温冰柜 分光光度计 接种针 试管 离心管 离心管 冰浴 微量进样器 吸头 |
实验步骤 | 一、实验仪器、材料和试剂
1. 仪器
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌,灭菌条件:120℃,15分钟。
2. 材料
3. 试剂
(2)利福平(Rif)储液:50 mg/ml
(3)20 mM CaCl2,高压灭菌。
二、实验步骤
1. 挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3 ml的YEB液体培养基(含Rif 50 mg/l)中,28℃振荡培养过夜。
2. 取过夜培养菌液1 ml接种于50 ml YEB(Rif 50 mg/l)液体培养基中,28℃振荡培养至OD600为0.5。
3. 取2 ml菌液,13 000 rpm,离心30 sec,弃上清。
4、加入1000 μl 20 mM CaCl2,使农杆菌细胞充分悬浮,冰浴30 min。
5、13 000 rpm,离心30 sec,弃上清,置于冰上,加入500 μl预冷的20 mM CaCl2,充分悬浮细胞,冰浴中保存,24 hr内使用,或液氮中速冻1 min,置-70℃保存备用。 |