细胞计数实验——细胞计数实验
| 实验方法原理 | 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞牛长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的 2～3 或更多个细胞。因此平板密落计数的结果往往偏低。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。 |
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| 实验材料 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 编号： 取无菌平皿 9 套，分别用记号笔标明 10-4 、10-5 、10-6 各 3 套。另取 6 支盛有 4.5 ml 无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明 10-1 、10-2 、10-3 、10-4 、10-5 、10-6 。 2. 稀释 用 1 ml 无菌吸管吸取 1 ml 已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放 0.5 ml 至 10-1 的试管中，此即为 10 倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。 将 10-1 试管置试管振荡器上振荡。使菌液充分混匀。 另取一支 1 ml 吸管插入 10-1 试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。 用此吸管吸取 10-1 菌液 1 ml，精确地放 0.5 ml 至 10-2 试管中，此即为 100 倍稀释……其余依次类推，整个过程如图 Ⅷ-3 所示。 3. 取样 用 3 支 1 ml 无菌吸管分别精确地吸取 10-4 、10-5 、10-6 的稀释菌液各 1 ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。 4. 倒平板 尽快将上述盛有不同稀释度菌液的平皿倒入溶化后冷却至 45℃ 左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约 15 ml/平皿，置水平位置，迅速旋动混匀，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。 待凝固后，倒置于 37℃ 温室中培养。 5. 计数 培养 48 小时后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算： 每毫升中菌落形成单位 = 同一稀释度三次重复的菌落平均数 × 稀释倍数 × 5 一般选择每个平板上长有 30～300 个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。由 10-4 、10-5 、10-6 三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊，如相差较大，表示试验不精确。 平板菌落计数法的操作除上述倾倒平板的方式以外，还可用涂布平板的方法进行（见微生物的分离和纯化实验）。二者操作基本相同，所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，待凝固后编号，并于 37℃ 温室中烘烤 30 分钟左右，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上 20～30 分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于 37℃ 的温室中培养 24～48 h。 展开 |
| 注意事项 | 1. 放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。 2. 不要用 1 ml 吸管每次只靠吸管尖部吸 0.2 ml 稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。 3. 由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并已冷却至 45℃ 左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。 4. 平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在 50 个左右为最好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。 5. 涂布平钣用的菌悬液量一般以 0.1 ml 较为适宜，如果过少，菌液不易涂布开；过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。 展开 |
| 其他 | 为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 |
