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如何解决台盼蓝染色PBMCs进行细胞计数的问题？

2021.3.08

“为什么很难用台盼蓝染色剂来计数PBMC！有大的，小的，成团的……；你能告诉我怎么在未染色的细胞中挑出有核细胞？”小编经常被问到各种各样关于如何计数PBMC的问题，今天就借此机会跟大家分享一下。

首先，了解下人类PBMCs的组成

外周血单核细胞(Peripheral blood monoculear cell, PBMC),大部分都是淋巴细胞，包括B细胞和T细胞，其中CD3 T细胞又占了淋巴细胞中绝大部分(45-70%)。相对于淋巴细胞，单核细胞的比例在10-30%，受到刺激之后会发育成树突状细胞(DC)或巨噬细胞。干细胞的比例非常低，只有0.1-0.2%。红细胞和血小板没有核，主要负责运送氧。

传统计数PBMCs的方法

原代细胞，对于传统的计数方法，绝对是一种挑战！原代细胞悬液中包含各种异质性的细胞类型和在消化过程中产生的细胞碎片。而且，因为样品采集的部位不同，来源的病人不同，以及分离过程中的差异，样品往往千差万别。PBMC研究要求精确地判断细胞死活，数量等等，对于进行后续的实验非常重要。

在传统的血球计数板+显微镜模式下，很难把PBMC细胞和红细胞分开来。PBMC细胞在光镜下，和肿瘤细胞相比很小，红细胞两面凹的形态，只能通过经验和更加灵敏清晰的显微镜进行人为识别。因此引入太多的人为因素，而导致误差极大，也会使操作者疲惫不堪。

因此有研究人员尝试用台盼蓝进行PBMC的死活的鉴定。台盼蓝是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定染色方法之一。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。 PBMC分离过程中，会有红细胞的残留，虽然红细胞没有核，但是大小与PBMC接近；因为胞膜完整，所以红细胞也不会被染成蓝色，因此传统台盼蓝方法不能分辨红细胞与活的PBMC，红细胞也将被误认为是PBMC细胞，影响PBMC的活率和活细胞总数。

另外，PBMC实验还有其自身的特点：1. 随着时间的延长，细胞质量下降；2. 许多单细胞测序的相关实验，需要快速准确计数细胞死活和判断细胞结团情况，决定样本是否适合上机检测。所以，快速计数，并得到准确的结果是保证后续实验顺利进行的关键。

精准的荧光计数法

公认标准的荧光细胞计数法采用AO/PI染料双染细胞核来检测细胞的状态。AO/PI试剂由可以发出绿色荧光的DNA结合染料吖啶橙（AcridineOrange，简称AO）和可以发出红色荧光的DNA结合染料碘化丙啶（Propidiumiodide，简称PI）组成。其中AO可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞（活细胞和死细胞）的细胞核，呈现绿色荧光；PI只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光。

当两种染料均存在于细胞核内，在合适的AO、PI配比下，两种染料发生能量共振转移，死细胞在绿色通道下激发出红色荧光。由于AO和PI为DNA结合染料，因此可有效排除杂质以及红细胞的干扰，确保对样品进行准确计数。