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染色体制备

2019.10.20

           

实验方法原理 固定阻滞于分裂中期的细胞，在低渗液中膨胀，将细胞滴在载玻片上，染色，观察 [ Rothfels and Siminovitch，1958；Rooney and Czepulkowski，1986 ] 。
实验材料

D-PBS 0.25%胰蛋白酶 对数期的培养细胞 秋水仙酰胺

试剂、试剂盒

低渗溶液 醋酸甲醇固定液 Giemsa染液 DPX或Permount封固剂 冰

仪器、耗材

离心管 巴斯德吸管 载玻片 盖玻片 载玻片盒 低速离心机 涡流混悬器

实验步骤

1. 将 2× 104~ 5× 104 个细胞 /ml （4× 103~ 1× 104 个细胞 /cm2） 20 ml 在 75 cm2  的培养瓶中培养。

2. 约 3.5 天后，细胞处于对数生长期时，将 0.2 ml 的 1×10-5 mol/L 的秋水仙酰胺（用 D-PBSA 配制）加入培养瓶内已有的培养基中，终浓度 1×10-7 mol/L 。

3. 4~6 小时后，轻轻去掉培养基，加 5 ml 0.25% 胰蛋白酶，孵育 10 min。

4. 在胰蛋白酶液中离心细胞，弃掉上清胰蛋白酶。

5. 以 5 ml 低渗溶液（0.04 mol/L KCl ; 0.025 mol/L 枸橼酸钠）重新混悬细胞，37℃ 下静置 20 min 。

6. 加入等量新鲜配制的冰冷的醋酸甲醇（一份冰醋酸加三份无水甲醇或乙醇，新鲜配置并在冰上保存），不停地混合，然后以 100 g 速度离心 2 min。

7. 弃掉上清混合物，在涡流混悬器上震荡细胞团块，再慢慢边混勻边加新制备的醋酸甲醇。

8. 细胞在冰上静置 10 min。

9. 以 100 g 速度离心细胞 2 min 。

10. 弃掉上清醋酸甲醇，以 0.2 ml 的醋酸甲醇溶液，重新振荡混悬细胞团，直到细胞均匀分散。

11. 用吸管吸一滴细胞悬液到吸管尖部，从约 12 英寸（30 cm） 处滴到凉的玻片上，倾斜玻片，让液滴流下并铺开。

12. 将玻片在烧杯沸水上迅速干燥，然后用相差显微镜观察。如果细胞均匀铺展而没有相互接触，则以同样浓度的细胞制备更多片子。如果细胞成堆重叠出现，则稀释悬液 2~4 倍之后，再制备一张滴液玻片。如果满意，就制备更多片子，若不满意，重复这一步骤进一步稀释。

13. 进行 Giemsa 细胞染色：

(a)将玻片放在架子上，架子放在水池上。

(b)以数滴纯 Giemsa 染液完全覆盖玻片，染色 2 min 。

(c)以约 10 倍体积的水淹没玻片。

(d)再静置 2 min。

(e)用流动水冲掉稀释过的染液。

(f) 最后用水逐张冲洗玻片去除染液沉淀。

(g)显微镜下观察染色情况，如果满意，则将载玻片彻底干燥，用#00盖玻片及 DPX 或 Pennoum 封片。

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注意事项

必须倒掉染色液，因为氧化的染色液浮渣会留在玻片上。即使在平皿中染色，染液也不能倒掉，而必须用水从下向上置换掉。


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