台盼蓝(Trypan Blue)染色法技术要点（三）
台盼蓝浓度
不同的台盼蓝浓度对细胞染色会有不同影响吗？Nexcelom的科学家们将同一Jurkat细胞样本与0.4%，0.2%，0.1%，0.05%和0.025%的台盼蓝以1：1比例混合，以下是部分浓度染色后的细胞图片：
下面的直方图统计了不同浓度台盼蓝检测到的死细胞（较深着色）和“气球”状细胞的浓度。
高浓度的台盼蓝更容易使死细胞破裂产生“气球“，而当”气球“颜色特别浅的时候容易被漏数。低浓度的台盼蓝不会产生”气球“状细胞，但过低的浓度可能不足以染上所有死细胞，使得检测不够灵敏。这两种情况都会导致死细胞被低估，即存活率被高估[1]。Nexcelom公司建议所有Cellometer用户使用0.2%的台盼蓝和细胞样本1：1混合后（终浓度0.1%）上机检测。
为了进一步研究不同浓度台盼蓝对细胞形态产生的影响，研究者分别用明场光学显微镜和相差显微镜对0.4%和0.1%台盼蓝染色的细胞进行拍照。
台盼蓝染色时间
台盼蓝是一种具有毒性的化学染料，若染色时间过长除了死细胞也会渗入活细胞，降低细胞的存活率。Mascotti等人在2000年发表的一篇文献中专门研究了台盼蓝和AO/PI对细胞的毒性[2]。作者们将HPC细胞和0.4%台盼蓝或AO/PI染料混合后放置在室温。在此后的2小时测量时间中，前一小时每隔10分钟取一次样计数，后一小时每隔15分钟取一次样计数。
上图记录了每个时间点两种方法测得的存活率。AO/PI（实心点）染色的细胞在2小时区间内始终保持很高的存活率（~98%），而台盼蓝（空心点）染色的细胞存活率从96.2%降到了89.8%。由此可见AO/PI对细胞的毒性非常小，而台盼蓝对细胞的毒性在2小时内已经十分明显。所以台盼蓝染色后需要尽快完成细胞计数，一般建议不要超过10分钟。
总结
综上所述，要想用台盼蓝染色做好细胞计数和存活率分析，必须
1）样本中杂质少，且存活率在80%以上；
2）死细胞的状态恰到好处，能”Hold”住台盼蓝；
3）台盼蓝浓度适中；
4）染色时间不超过10分钟。
如果无法同时满足这4个条件，那么赶紧使用以AO/PI为代表的荧光核酸染料吧。
如果你还对什么时候选择什么染料有疑惑，请大胆留言或毫不犹豫地骚扰Nexcelom小编
