分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

Southern 印迹实验——电转印法

2019.3.26

实验方法原理	因为聚丙烯酰胺凝胶的扎径太小，DNA不能在其横截面上有效地扩散，毛细管转移法不适用DNA从聚丙烯酰胺凝胶的转移。因此，聚丙烯酰胺凝晈必须在低离子强度的缓冲液中用电转移法进行印迹。
实验材料	DNA
试剂、试剂盒	TBE
仪器、耗材	Scotch-Brite垫 Whatman滤纸
实验步骤	1. 在非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳DNA样品。 2. 电泳将近结束时，将一张大小足以覆盖凝胶中相应部分的尼龙膜漂浮于蒸馏水表面，然后浸入水中泡5 min。 3. 从电泳装置中取去一块玻璃板，染色后对凝胶进行照相（如果是非变性胶）在凝胶的表面铺一张Whatman 3 MM 滤纸，排去其间的所有气泡。 4. 揭起滤纸将凝胶剥离玻璃板。 5. 将2块Scotch-Brite垫浸泡于0.5XTBE电泳缓冲液中，反复挤压和振动除去气泡。 6. 裁7张与凝胶大小相等的Whatman 3 MM 滤纸，浸于0. 5×TBE电泳缓冲液中15~30 min。 7. 将一块饱和过的Scotch-Brite垫置于凝胶容器中灰色嵌板的内表面，将3张浸湿的滤纸置于其上，一次放一张，排去其间的气泡。 8. 将贴着凝胶的滤纸用0.5×TBE浸没，置于上述滤纸层之上4将凝胶的表面用0.5xTBE浸没，将预先浸湿的膜置于凝胶之上。 9. 用0.5xTBE浸没膜的表面，将剩余旳4张饱和过的Whatman 3 MM 滤纸置于其上。 10. 再加上另一块饱和过的Scotch-Brite垫，关上凝胶容器。 11. 用0.5xTBE半充满下Tras-Blot电转印室，将凝胶容器置于其中，使灰色嵌板面向阳极。 12. 加入0.5xTBE充满转印室，打开冷却装置，在30 V 下进行电转印。 13. 取下膜，用铅笔作好标记或切去一角标示膜的方向。 14. 从非变性凝胶转印的膜要进行变性，DNA面朝上，凝胶在3张用0.4 mol/l NaOH 浸泡过的Whatman 3 MM 滤纸之上放置10min。 15. 用2xSSC漂洗膜，置于一张Whatman 3 MM 滤纸上晾干，固定其DNA。将膜保存于室温。