脂肪来源干细胞的取材与分离实验
从小鼠腹股沟脂肪垫获取ASCs
| 实验方法原理 | 人和小鼠的脂肪组织均可用于分离ASC，可以获得相当数目的ASCs。人脂肪组织通常来源于抽脂。小鼠脂肪组织则取自腹股沟处脂肪垫。 |
|---|---|
| 实验材料 | 小鼠 4〜6只 |
| 试剂、试剂盒 | Hank’s缓冲盐溶液（HBSS) ASC培养基 胶原酶溶液 聚乙烯吡咯酮碘溶液 麻醉剂：三溴乙醇 37℃水浴 |
| 仪器、耗材 | Petris培养皿 9 cm 离心管 50 ml 组织培养瓶 25 cm2 剪刀（2把） 镊子（2把） |
| 实验步骤 | (a)37℃水浴中预热HBSS和ASC培养基。 (b)麻醉动物后处死。 (c)转移动物至层流净化罩中。 (d)70%酒精消毒腹部。 (e)采用低位横向切口打开腹腔。 (f)用镊子取出性腺/附睾和腹股沟处的脂肪垫。 (g)将脂肪置于培养皿中，加入HBSS。 (h)待所有动物脂肪取出后，将脂肪转移至新的培养皿中。 (i)加人含有5%聚乙烯吡咯烷碘酮的HBSS 2〜3 min。 (j)漂洗组织并用HBSS洗涤脂肪。 (k)用无菌镊子将脂肪转移至50 ml离心管中。 (l)用无菌剪刀将脂肪切碎。 (m)加入与组织体积相同的胶原酶溶液并混匀。 (n)将离心管置于37℃水浴中60 min,其间不时混匀一下。 (o)离心，50〜100 g，5 min。 (p)取出离心管，用力摇晃（将基质细胞与原代脂肪细胞完全分离），再次离心5 min。. (q)小心吸去上层油脂，油脂层中含有原代脂肪细胞，注意不要破坏位于下方的基质-血管细胞层。 (r)加人5〜10 ml PBSA,重悬沉淀，再次离心5 min。 (s)洗涤三次，注意不要吸走基质-血管细胞层。 (t)最后一次洗涤后，加人8 ml ASC培养基重悬沉淀，转移至T25培养瓶中，置于37℃,5% CO2温箱中。 (u)待细胞贴壁生长2〜4天后换液。 (v)换液时通过弃去培养基，从而去除未贴壁的细胞。 (w)以后每周更换培养基2次。 展开 |
推荐
