原位杂交实验要求及步骤（二）
三、操作步骤
（一）取材、冰冻切片：
将动物以3%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，暴露心脏，刺破右心耳，将针尖刺入左心室用生理盐水灌注（灌注量约为动物体重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（见图2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M
PBS浸泡冲洗4-5次（换液：1次/hr）。将组织块入30%蔗糖/0.1M
PBS液（4℃），1-2天后冰冻切片，将切片裱贴于原位杂交专用玻片上，切片厚度为15-20μm。
（二）探针制备与检测（定量）：
1．随机引物制备cDNA核酸探针
以DIG DNA 标记检测试剂盒为例：
（1）探针制备：
①模板DNA(0.5-3μg) 15μl，100℃变性10min，冰浴5 min。
②在冰浴中加：Hexanucleotide mix 2μl, dNTPmix 2μl, Klenow Enzyme 1μl，反应总体积为20μl。37℃孵育过夜。
③在上述20μl的标记产物中加4M
LiCl 2.5μl, 75μl（无水乙醇预冷）,轻轻混匀，-20℃放置 2hr。4℃离心12000g×15min，弃上清。70%乙醇(预冷)
50μl洗涤，7500g×5min，弃上清，晾干沉淀,加TE 50μl溶解沉淀，-20℃保存备用。
（2）探针敏感性检测：
①样品稀释：取dig-标记探针1μl 用ddH2O以1:10、1:100、1:1000、1:1000、1:10000梯度稀释。
②取一张与点样器大小相近的尼龙膜，标记方向，ddH2O中浸泡 1min，6×SSC中浸泡10min，置点样器上，负压抽吸5min。
③将上述样品点于尼龙膜上，继续抽吸10min。
④取下尼龙膜，置紫外灯下10cm处照射5min，晾干。
⑤将膜置于适量预杂交液（5-10 ml）中，37℃预杂交10min。
⑥加入Anti-dig 抗体（1:5000），37℃杂交30min。
⑦洗膜：2×SSC/0.1%SDS室温洗10 min×2次。
⑧显色：15 mlTSM2中加300μl显色液（NBT/BCIP），37℃避光显色30min。
1． PCR法制备cDNA核酸探针：
（１） 探针制备：
以PCR DIG Probe Synthesis Kit 为例：
在0.5ml离心管中，依次加入：
PCR 引物 1（10pM） 2μl
PCR 引物 1（10pM） 2μl
质粒DNA 模板（10-100pg） 2μl
PCR DIG mix 2μl
(含dNTP和DIG-11-dUTP)
dNTPmix 2μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶（2u/μl） 1μl
加入适量ddH2O，使总体积达50μl。
① 将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 45s → 58℃ 45s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。
②
在上述PCR产物中加入4M LiCl 12.5μl、预冷无水乙醇375μl，轻轻混合后置于-20℃2hr,
12,000g×15min，弃上清。70%乙醇(预冷) 120μl洗涤沉淀，离心7500g×5min，弃上清，晾干沉淀,加TE
50μl溶解,-20℃保存备用。
（2）探针检测：
行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察DIG-DNA探针含量（采用目测法）。
（三）原位杂交反应（以DIG-cDNA探针为例）：
1．0.1M PBS (pH 7.2) 浸 5-10min。
2．0.1M甘氨酸/0.1M PBS 浸5min。
3．0.3%TritonX-100/0.1M PBS 浸10-15min。
4．0.1M PBS 洗 5min×3次，加蛋白酶K(1μg/ml)，37℃孵育30 min。
5． 4%多聚甲醛浸5min。
6． 0.1M PBS 洗 5min×2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。
7．预杂交：滴加适量预杂交液，42℃ 30 min。
1． 杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20μl杂交液（将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5 ng/μl ），覆以盖玻片或蜡膜，42℃ 过夜。（阴性对照
2． 洗片：
(1) 4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min；
0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC与0.1M PBS各半洗10min；
0.05M PBS 洗 5min×2次。
10．3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃ 30min.
11． 滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物（以抗体稀释液1:5000稀
释）4℃孵育过夜。
12． 0.05M PBS洗15min×4次; TSM1 10min×2次; 新鲜配制TSM2 10min×2次。
13． 显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜。
14． 将玻片置于TE中10-30min以终止反应。酒精梯度脱水、二甲苯脱脂，中性树胶封片。
15．显微镜下观察结果。四、注意事项：
１． 作为DNA-RNA的杂交，需防RNase的污染。
cDNA探针在杂交时必须变性解链。具体方法是：将探针置100℃加热5min，冰浴骤冷。
