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接种完新冠疫苗竟有如此差异？

美谷分子仪器

2022.1.07

自 2019 年底新冠疫情爆发以来，全球累计确诊病例已超 2.6 亿例，死亡人数突破五百万^[1]，全世界人民的生活受到极大的影响。近期新冠病毒超级变异毒株“奥密克戎”的出现，让疫情形势变得越发的严峻。

新冠肺炎是由严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 （SARS-CoV-2）感染所引起。冠状病毒是一类有包膜的单股正链 RNA 病毒^[2]， SARS-CoV-2 为其中 β 属的新型冠状病毒，形状为圆形或者椭圆形的皇冠样，直径约为 60-140nm^[3]。研究表明，其作用机理是通过病毒表面的刺突蛋白 S 与血管紧张素转化酶 2 （ACE2）相结合从而侵入宿主细胞^[4]。该病毒传染性极强，人群普遍缺乏抵御该病毒的免疫能力，因此开发相关疫苗并积极引导接种是当前世界各国抵御疫情局面恶化的主要手段。

目前国内外已获批紧急使用授权或者附条件上市的疫苗种类众多，所采用的技术开发路线更是琳琅满目，灭活、重组蛋白、腺病毒、 mRNA 等等。尽管各款疫苗的临床数据均表现出相对较好的保护效果和安全性，但因为研发周期相对较短，甚至 mRNA 疫苗是首次在人类社会进行大规模注射，不良反应的报道偶发，对疫苗的真实世界研究一直在进行着。在现代生物技术快速发展的同时，有一项专门用于在疫苗临床试验期间直至疫苗使用后的免疫监测的技术也在不断更新，叫做病毒中和抗体检测技术。

病毒中和抗体检测技术目前最常见的应用就是医院提供的 “疫苗抗体滴度检测”服务，它常用于评价接种某种疫苗后人体内产生相应抗体的多少。抗体滴度指的是某种抗体识别其特异性抗原表位所需要的最大稀释倍数，简单来说，滴度越高，代表体内产生的抗体越多，疫苗接种的效果就越好。检测抗体滴度使用 ELISA （酶联免疫吸附测定）的方法，分别测定实验组和对照组在 450nm 波长处的吸光度，从而计算实验组和对照组吸光度比值 ≧ 2.0 时的最大的血清稀释倍数^[5] 。

为了满足研究者们的实验需求，越来越多的病毒中和抗体检测技术被开发并投入使用，其中曾经使用较多的分别是蚀斑减少中和试验（ PRNT )和假病毒中和抗体测试法 ^[5]。

病毒感染细胞以后，释放的病毒由细胞向外扩散，经过几个细胞增值周期以后，形成一片病变细胞区，该区域即为病毒蚀斑，而蚀斑减少中和实验则以蚀斑减少 50% 的血清稀释度作为效价。该方法曾在 OIE （国际动物卫生法典）第六版中被列为对裂谷热的标准诊断方法之一，但是该操作方法需要活的具有感染性的病毒，因此普通生物安全二级实验室不符合实验要求，而且操作步骤较繁琐，人为操作因素对结果影响较大。

假病毒中和抗体测试法则大多使用含有报告基因的嵌合假病毒，通过测定报告基因表达蛋白量的变化来反映病毒量的变化。常用的报告基因有萤火虫荧光素酶（ Fluc ）和海肾荧光素酶（ Rluc ），这使得这一类实验具有高灵敏度，宽动态范围以及简单易用的特点，能够在普通生物安全二级实验室内完成。但是此方法需要细胞培养和发光成像来测得中和抗体活性，因此，也不适用于样品的高通量筛选。

基于该特点， GenScript （金斯瑞生物）开发了一种采用免病毒中和测试法（ sVNT）的新冠病毒中和抗体检测试剂盒 GenScript cPass 。

其原理如下：

表 1 .新冠病毒 sVNT 检测方法。此实验使用 ELISA 模式，在待测样本中通过中和性的抗体能够检测 RBD 与 ACE2 结合的扰动。

相比较于传统的蚀斑减少中和实验 PRNT , 免病毒中和测试法 sVNT 能够将实验时间从 2.5 天缩短至短短一个小时，节约了宝贵的时间。

在实验完成后，将 96 孔板放入 Molecular Devices 品牌 SpectraMax iD5 酶标仪中进行读数，光吸收波长设置为 450nm 。

各个待测样本的百分比抑制值

按如下公式计算：

实验结果的有效性评估看阴性对照的 OD450 值是否大于 1.0 ，阳性对照的值是否小于 0.3 。如果不符合这些标准，实验结果无效，需要重复试验。结果如下：

表 2 .阴性对照的 OD450 值大于 1.0 ，阳性对照的 OD450 值小于 0.3 ，验证了实验结果。对照组做一次重复实验，变异系数 CV 值小于 30% 是可重现的。

表 3.先前测得的多个样品的百分比抑制值和阳性、阴性结果。

此 GenScript cPass 新冠病毒中和抗体检测试剂盒数据来源于一组患者血清样本，与传统的、耗时费力的 PRNT 方法获得的数据吻合。该试剂盒提供了易于使用的试剂和紧凑的 ELISA 工作流程，使得整个过程能够于大约 1 小时完成，简单方便。

同样， Enzo 也开发了一种更先进的基于酶联免疫吸附实验( ELISA ) 方法，针对性地优化了检测人血清和血浆样本中抗 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白和刺突糖蛋白的 IgG 抗体，是一种准确度及通量高，可以同时快速检测人类样本核衣壳蛋白 IgG 抗体和刺突蛋白 IgG 抗体的解决方案。

该试剂盒使用 Molecular Devices 品牌 SpectraMax ABS Plus 酶标仪进行读数。实验步骤如下图：

表 4 . 2 个 SARS-CoV-2 ELISA 试剂盒的操作步骤。

最终的 OD 值由所有孔的 OD 值减去空白孔的平均 OD 值计算，包括阴性对照、低阳性对照、高阳性对照和血清样本。

计算每个样本的指标值：

并在 SoftMax Pro 软件中使用 4 参数 logistic 曲线拟合绘制。

图 1 . SARS-CoV-2 核衣壳蛋白 IgG ELISA 试剂盒标准曲线。

对于这两种 ELSA 试剂盒，COVID-19 阳性患者的血清样本均呈阳性，这意味着所有这些样本都含有核衣壳蛋白 IgG 和刺突蛋白 IgG。根据上图绘制出来的曲线，对结果进行半定量计算。

表 5 . SARS-CoV-2 刺突蛋白 IgG ELISA 试剂盒。结果通过标曲插值半定量计算，并在 SoftMax Pro 软件中显示在组表中。“ R ”表示样品的 OD 值超出了标曲的范围。

表 6 . SARS-CoV-2 刺突蛋白 IgG ELISA 试剂盒检测结果计算指标值。样本结果在 SoftMax Pro Software 的组表中以阳性或阴性显示。

结果

结果表明，该方法特异性高，通量高，能够获得优越的检测间/ 内精度的比色读数，是研究 COVID-19 免疫和抗体应答非常可靠有效的方法。

随着疫苗研发的投入越来越多，病毒中和抗体检测方法也将随之不断改进和发展，相信其会发挥越来越重要的作用。

文献引用：

[1]"Arcgis Dashboards". Arcgis.Com, 2021, https://www.arcgis.com/apps/dashboards/index.html#/bda7594740fd40299423467b48e9ecf6.

[2] 戚中田. 医学微生物学.第3版. 科学出版社, 2014.

[3] Zhu Na, et al."A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019.." The New England journal of medicine 382.8(2020): doi:10.1056/NEJMoa2001017.

[4] Markus Hoffmann, et al."SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor." Cell 181.2(2020): doi:10.1016/j.cell.2020.02.052.

[5]丁如霞, 王佑春,and 黄维金."病毒中和抗体检测方法研究进展." 微生物学免疫学进展 49.04(2021):61-65. doi:10.13309/j.cnki.pmi.2021.04.010.