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项目文章 | 宁波大学王春琳团队运用代谢组探究青蟹适应急性盐度变化的主要因素

鹿明生物

2022.3.18

前言

2021年11月，宁波大学海洋科学学院王春琳团队在Frontiers in Marine Science期刊发表了题为“Metabolic Changes in Scylla paramamosain During Adaptation to an Acute Decrease in Salinity”的研究成果，通过LC-MS非靶向代谢组学研究方法，发现了氨基酸和能量代谢是参与青蟹适应盐度变化的主要因素，而脂质代谢物起辅助作用。

基本信息

中文标题：青蟹在适应盐度急剧下降过程中的代谢变化

研究对象：青蟹

发表期刊：Frontiers in Marine Science

影响因子：4.912

发表时间：2021年11月2日

合作单位：宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室

运用生物技术：LC-MS非靶向代谢组(由鹿明生物提供技术支持)

研究背景

青蟹是一种广盐甲壳类动物，广泛分布于从印度洋到西太平洋地区，包括中国东南沿海地区，它对盐度的突然降低极其敏感。青蟹生活在咸水和咸水河口，成熟的雌性迁徙到近海繁殖，而这些地区容易受到大雨或水环境大规模变化的影响，导致盐度急剧下降。大幅度降低盐度可能会超过青蟹调节渗透压的能力，从而导致死亡。因此，青蟹适应急性盐度降低的生物学机制需要进一步的探索。

研究思路

研究方法

1.实验分组

(1) CK组: 海水盐度为23 psu、温度为20°C

(2) LS组: 海水盐度为3 psu、温度为20°C

2.鳃中血清渗透压和酶活性的测定：ELISA检测

3.LC-MS非靶向代谢组学分析

研究结果

盐度急速降低对青蟹血淋巴渗透压的影响

盐度从23下降到3 psu后，青蟹的血淋巴渗透压开始迅速下降，在6 h达到最低点606.50 mOsm/kg H₂O，然后开始上升，在24 h达到最高点，在它缓慢下降并在 48 小时后稳定之前（图 1A）。

图1 | 盐度对青蟹血淋巴渗透压的影响。

(A)显示了盐度变化下青蟹渗透压的变化；

(B)是青蟹和海水的渗透压等渗图。在(B)中，D1和C1分别是青蟹在盐度23和3的血淋巴渗透压，C2和D2分别是23和3 psu的海水渗透压。

海水盐度为 23 psu时，海水的渗透压 (D2) 为 601.75 mOsm/kgH₂O，青蟹血淋巴的渗透压 (C2) 为726.75mOsm/kg H₂O(图 2B ) ; 当海水盐度降至 3 psu 时，海水的渗透压（D1）为 77.18 mOsm/kgH₂O，青蟹血淋巴的渗透压为 642.38 mOsm/kgH₂O（图 2B）。可以看出，在3~23 psu的环境中，青蟹的渗透压始终高于海水的渗透压，并且青蟹的渗透压不会随着海水渗透压的快速下降而大幅度降低。

图2 | 盐度对青蟹鳃离子转运酶活性的影响

* 表示不同盐度下离子转运酶活性同时存在显著差异。

盐度急速降低对青蟹鳃中参与渗透压调节相关酶活性的影响

对当盐度从23 psu降至3 psu时，Na⁺-K⁺-ATPase活性在6 h后升高至31.53 U/mL，该值明显高于CK组。24 h 后活性逐渐下降，最终达到 24.28 U/mL 的平衡状态（图 2A）。CA 活性在前 6 小时内增加，此后保持在此稳定状态。此外，LS组的CA活性（16.54 U/mL）显著（1.8倍）高于CK组。V-ATPase 活性在前 6 小时内增加，达到 21.88 U/mL，然后稳定下来（图 2）。

盐度骤降引起青蟹鳃的代谢物变化

采用LC-MS非靶向代谢组学检测CK和LS蟹鳃代谢组的变化。经过数据处理，共检测到 16,261 个质谱特征信号，鉴定出 4,023 种代谢物。鳃提取物的可检测代谢物含有脂肪酰基、羧酸及其衍生物、甘油磷脂等。

图3 | LC-MS非靶向代谢组学分析

在 ESI (+) (A)和 ESI (-) (B)中来自QC样品的鳃样品的BPC；青蟹的CK和LS的PCA得分图(C)、OPLS-DA 得分图(D)和响应排列测试(E)。

研究者运用主成分分析（PCA）、质量控制 (QC) 等进一步证实了数据的可靠性。PCA结果显示CK组和LS组有比较明显的分布规律（图3C）。同时，OPLS-DA 模型显示两组之间的差异显著（x 轴方向），所有样本点均在 95% 置信区间内（图 3D）。通过对OPLS-DA模型的拟合检验，可以发现模型对样本的解释能力[R2Y(cum)]和预测能力[Q2(cum)]分别为0.992和0.944。此外，直线的斜率较大，Q2 的截距为-0.646，说明 OPLS-DA 模型没有超出拟合（图 3E）。综上所述，OPLS-DA模型具有良好的解释和预测能力，能够真实反映不同样本组之间的差异。以上结果均表明，与23 psu海水相比，3 psu海水条件下青蟹鳃的代谢物发生了明显变化。

筛选差异代谢物

之后研究者通过多维分析、一维分析和火山图分析（图4A），筛选出LS组和CK组之间的差异代谢物。共筛选出LS组519种不同代谢物，其中上调代谢物288种（表2），下调代谢物231种（表3）。

图4 | 差异代谢物筛选

（A）LS和CK组差异代谢物火山图红色原点代表显著上调的差异代谢物，蓝色原点代表显著下调的差异代谢物，灰色原点代表差异不显著的差异代谢物；青蟹鳃组织中CK和LS的差异代谢物分类饼图：（B）上调差异代谢物和（C）上调差异代谢物。

不同代谢物的代谢途径分析

研究者通过差异代谢物的代谢途径富集分析，共得到63条代谢途径，其中有13条重要的代谢途径，分别为氨基酸代谢/其他氨基酸代谢、信号转导、碳水化合物代谢、辅因子和维生素的代谢、核苷酸代谢（嘌呤代谢）、膜运输、核苷酸代谢、信号分子和相互作用，以及脂质代谢（图 5A）。此外还有包括氨基酸代谢/其他氨基酸代谢，碳水化合物代谢等50 个非显著富集代谢途径。从分类可以发现，显著代谢途径和非显著途径均主要与氨基酸、信号转导和能量代谢有关。

图5 | 青蟹鳃组织中适应低盐度的代谢途径分析

饼图分类：显著富集（A）和非显著富集（B）；青蟹适应低盐度的前 20 种代谢途径的代谢组视图图（C）。

通过 GC-MS/LC-MS 进行相关性分析

为了更全面地揭示青蟹对低盐度的适应代谢机制，研究者对GC-MS和LC-MS进行了相关性分析。发现甜菜碱、牛磺酸、天冬酰胺和天冬氨酸等与渗透调节相关的氨基酸出现上调。并且它们之间存在很强的正相关关系。此外，这四种氨基酸与富马酸、6-磷酸葡萄糖酸、PC(15:0/20:5)、PE(18:2)、PS[O-20:0/18:1(9Z) ]，其他代谢物与 LysoPC(20:4)、LysoPC(18:1)、LysoPC(20:5)、乙醇酸、咪唑丙烯酸等呈正相关，均下调，呈强负相关（图6）。

图6 | 前50种不同代谢物的相关性分析图；

相关性分析图表示不同物质表达水平之间的相关性，红色表示正相关，蓝色表示负相关。颜色越深，圆点越大，相关值越高。

相关分析共筛选出76条通路，其中显著差异代谢通路28条（P< 0.05)。（图 7A、C）和 48 条非显著差异代谢途径（P < 0.05）（图 7B）。

图7 | 青蟹鳃组织适应低盐度的代谢途径类饼图

相关讨论

文章研究结果表明，青蟹的渗透压并没有随着环境盐度的下降而持续下降，证实了 Na⁺-K⁺-ATPase 和 CA能够调节青蟹渗透平衡。LC-MS非靶向代谢组学的结果表明，甘油磷脂可能在青蟹渗透压调节中起主导作用，而甘油磷脂代谢主要参与磷脂酰胆碱（PC），磷脂酰乙醇胺（PE）、LysoPC和磷酸胆碱的调节。在此研究中，PC是上调最多的磷脂，这表明PC在青蟹的渗透压调节中起关键作用。GC-MS 和 LC-MS 数据的相关性分析表明青蟹渗透压的平衡主要依靠调节离子和氨基酸。氨基酸大多以自由扩散的方式进出细胞以维持渗透平衡状态。此外，一些与糖代谢和能量代谢相关的重要代谢途径可能也参与了青蟹渗透压的调节。

研究讨论

在这项研究中，研究者运用非靶向代谢组学指出了脂质和氨基酸在青蟹适应盐度急速下降中的作用和关系。首次阐明了通过细胞膜的运输发生的细胞渗透压调节的机制。这项研究结果可用于制定应急策略，以应对养殖环境中盐分的急剧下降，并改进内陆低盐度环境中的水产养殖技术。在青蟹的养殖中，在饲料中添加一定量的牛磺酸和甜菜碱或通过相关产物增强代谢途径，可以提高青蟹适应盐度急速下降的能力。

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参考文献

Anger, K., Riesebeck, K., and Püschel, C. (2000). Effects of salinity on larval and early juvenile growth of an extremely euryhaline crab species, Armases miersii (Decapoda: Grapsidae). Hydrobiologia 426, 161–168. doi: 10.1023/A:1003926730312

文末看点｜lumingbio

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