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项目文章 | 转录组学+蛋白组学助力甘农大孙万仓教授课题组研究白菜型冬油菜低温胁迫机制

鹿明生物

2022.4.20

前言

2021年12月欧易/鹿明生物合作客户甘肃农业大学孙万仓教授课题组在Scientific Reports期刊发表的题为 “iTRAQ-Based Quantitative Proteome Analysis Insights into Cold Stress of Winter Turnip Rapa (Brassica rapa L.) Grown in the Field ”的研究成果，通过iTRAQ标记蛋白组学+转录组学研究方法，探究了茎尖分生组织的形态对冬油菜低温耐受性中的作用。

基本信息

中文标题：iTRAQ标记蛋白质组学分析揭示了低温胁迫对田间生长冬油菜的影响

研究对象：白菜型冬油菜

发表期刊：Scientific Reports

影响因子：4.17

发表时间：2021年12月6日

合作单位：甘肃农业大学

运用生物技术：iTRAQ标记蛋白组学(由鹿明生物提供技术支持)、转录组学

研究背景

白菜型冬油菜（Brassica rapa L.）作为一种油料作物，可在中国北方寒冷干旱地区的冬季生存。因此，它在农业生产中具有显著的生态效益和经济效益。然而中国北方的极低温度影响了其种植区域的分布和产量。高通量测序技术已成功鉴定了白菜型冬油菜和叶中参与冷应激反应性的miRNAs、差异表达基因（DEGs）和差异积累蛋白（DAPs）。此外，研究发现低温敏感的白菜型冬油菜茎尖分生组织 (SAM) 形态突出，这使它们容易受到环境波动的影响，从而不能越冬。相反，耐寒白菜型冬油菜的SAM降低，抗寒性较强。这表明 SAM 在调控植物耐寒性方面的具有重要作用。

研究思路

研究内容

1. 研究材料

耐冻型Longyou 7和冷敏感型Lenox为材料

2. 研究方法

2.1形态学和生理学分析

2.2蛋白提取，蛋白质消化

2.3 iTRAQ标记结合LC-MS质谱分析：识别和定量细胞代谢变化

2.5统计分析：单因素方差分析(one-way ANOVA)分析，Duncan ''s多重比较检验

2.6 RNA提取及基因表达qPCR分析

研究结果

生理发育和耐寒性

通过观察低温胁迫下Longyou 7和Lenox苗期植株的形态和生理差异发现，Longyou 7的叶柄和叶片几乎匍匐生长，而 Lenox 的叶柄和叶片直立生长（图1A）。之后测定了野外不同生长阶段SAM水平的高度。与首次采样(CK) 相比， Longyou 7和Lenox的SAM 的高度增加，且地表水平均高度的Lenox显著高于Longyou 7（图1B）。与L7 d和Le CK相比，L7 CK和Le CK样品的SOD、POD活性和可溶性蛋白含量均显著降低。L7和Le CK组MDA含量显著增加。冰冻处理(0℃和-11℃)下，Le CK和Le d的MDA水平显著高于L7 CK和L7 d，Le CK和Le d的其他生理指标均低于L7 CK和L7 d(图1C)。这些结果表明，与Lenox相比，Longyou 7的SAM更小，但耐寒性更高。在从田间试验中发现Longyou 7等抗寒性强的品种的 SAM 较小，在土壤表面以下 5-10 厘米。因此，SAM位于温度相对稳定的遮蔽潮湿土壤中。这些结果表明幼苗SAM与耐寒性之间存在关联。

图1 | (A) Longyou 7和Lenox的生长特性。(B)Longyou 7和Lenox的SAM和项圈形态。(C) Longyou 7和Lenox越冬后的生理指标。大写表示有显著性差异(p<0.01)。数值为3个生物重复的平均值和SD值，均由3个技术重复的平均值计算。

iTRAQ标记蛋白组学分析

通过田间试验，研究了Longyou 7和Lenox低温驯化过程中的蛋白质组学变化。以iTRAQ为基础对Longyou 7和Lenox进行蛋白质组定量分析。共鉴定出6328个蛋白(补充表S1)。

iTRAQ定量鉴定的DAPs

实验发现当FC>1.5 (p<0.05)，DAPs累积增加，FC<0.8 (p<0.05)时，DAPs累积减少。在Le d /Le CK和L7 d /L7 CK之间有76个DAPs，在L7 d /Le d和L7 CK /Le CK之间有48个DAPs (图2A和2B)。其中L7 d /L7 CK有35个DAPs。这与3个生物重复的主成分分析(PCA)结果一致，说明每个样品的3个生物重复具有良好的重复性，L7 d /L7 CK和Le d /Le CK差异很大(图2C)。如图2D所示，L7 d /L7 CK中表达了111个DAPs，其中57个DAPs上调，54个DAPs下调(补充表S2)。L7 CK /Le CK共表达98个DAPs，其中29个DAPs上调，69个DAPs下调(补充表S3)。Le d /Le CK表达了183个DAPs，其中80个DAPs上调，103个DAPs下调(补充表S4)。在L7 d /Le d有107个DAPs表达，其中28个DAPs累积增加，79个DAPs累积减少(补充表S5)。

图2 | (A) iTRAQ鉴定的L7 d / L7 CK与Le d / Le CK之间的DAPs Venn图。(B)不同L7 d / Le d和L7 CK/ Le CK之间用iTRAQ鉴定的DAPs Venn图。(C)低温胁迫和冻害下冬油菜的3个生物重复蛋白质组的主成分分析图。(D)不同对照组的上下调蛋白数。

低温响应DAPs的分类

通过UniProt-GOA数据库和基因本体论(GO)注释对DAPs的功能进行了注释。在本研究中，GO注释到了2669个已知蛋白质。根据GO分析结果对DAPs进行细胞成分、生物过程和分子功能的划分(补充表S6)。如图3所示，与Le d /Le CK相比，L7 d /L7 CK在前10个生物过程中对苯丙素和淀粉分解过程的响应是唯一的。L7 d /L7 CK在前10个生物过程中对蔗糖、半胱氨酸型内肽酶活性的负调控、磷酸烯醇式丙酮酸转运、光合作用调控和磷酸丙糖跨膜转运的响应是唯一的。并且L7 d /L7 CK中淀粉分解过程均下调。

图3 | (A) L7 d /L7 CK下调DAPs的GO富集分析。(B) L7 d /L7 CK中DAPs上调的GO富集分析。

为了进一步表征DAPs的功能，作者还进行了KEGG分析。KEGG富集分析显示了L7 d /Le d之间DAPs的表达途径，L7 d /Le d上调的DAPs在谷胱甘肽代谢、硫醇代谢、淀粉和蔗糖代谢、酪氨酸代谢、脂肪酸降解、脂肪酸降解、淀粉和蔗糖代谢、酪氨酸代谢和脂肪酸降解中富集。糖酵解/糖异生、氧化磷酸化、苯丙素生物合成和内质网中的蛋白质加工。L7 d / Le d中41个下调的DAPs主要是富含谷胱甘肽代谢，亚油酸的新陈代谢，亚麻酸，磷酸戊糖途径等。

L7 d /L7 CK与Le d /L e CK相比，L7 d /L7 CK前20位的上调富集具有特殊型组氨酸代谢、转换型戊糖和葡萄糖醛酸、代谢型嘧啶、代谢型甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸、代谢型丙酮酸和RNA降解型。L7 d /L7 CK对下调富集前20的花生四烯酸代谢具有特异性(图4)。

图4 | (A) L7 d / L7 CK中下调的DAPs的Kyoto Encyclopedia of Genes和KEGG通路富集分析。(B) L7 d / L7 CK中上调的KEGG通路富集分析。

目标DAPs的qRT-PCR表达分析

利用qRT-PCR检测了转录产物的表达水平(图5)。本文随机选取17个基因来验证翻译水平数据的可靠性。在2个品种中这17个基因表现出与蛋白水平几乎相似的表达模式，仅MLP 328和ERD10的丰度与之相反，这可能是由于各种翻译后修饰所导致的。

图5 | DAPs相关基因的RT-qPCR分析。通过2−ΔΔCT的方法归一化靶基因与β-肌动蛋白转录本的周期阈值差异，计算转录本丰度。

研究讨论

本研究通过生理和蛋白质组学分析在冬油菜中鉴定了大量的冷胁迫响应蛋白。探讨了冬油菜耐冻性增强的机理和低温胁迫对冬油菜形态和生理生化变化的影响。文章以耐冻型Longyou 7和冷敏感型Lenox为材料，通过iTRAQ标记蛋白组学和转录组学分析，揭示了谷胱甘肽转移酶活性、碳水化合物结合和谷胱甘肽结合、代谢过程及IAA反应与冷应激反应密切相关，鉴定出了Longyou 7和Lenox之间的DAPs，这些DAPs参与氨基酸、碳水化合物、脂质和能量代谢，对提高冬油菜的耐冻性发挥了重要作用。

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冷胁迫响应蛋白在植物适应低温环境中发挥着重要作用。文章作者通过iTRAQ标记蛋白组分析对冬油菜耐冷胁迫的分子机制进行了研究。研究结果表明，DAPs参与氨基酸、碳水化合物、脂质和能量代谢，这表明DAPs极大地改变了植物的耐冻性。这些发现加深了我们对抗冻分子机制的认识，有助于培育抗寒胁迫品种。此项研究体现了组学技术在机制研究中的重要作用。

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