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好文悦读 | 热心“肠”动态，空间代谢组学技术助力炎症性肠炎疗法开发新策略

鹿明生物

2022.11.22

炎症性肠炎（IBD）发生期间激活的髓过氧化物酶(MPO)-卤化途径会导致宿主组织损伤并加剧炎症，而环状氮氧化物作为MPO抑制剂，具有抗炎和抗氧化活性，然而其在调节与IBD相关的炎症和损伤的功能与效应机制尚未得到专门研究。

本篇由悉尼大学查尔斯·帕金斯中心的Paul K.Witting教授/课题组在Redox Biology期刊发表的题为 “The nitroxide 4-methoxy-tempo inhibits the pathogenesis of dextran sodium sulfate-stimulated experimental colitis”（IF：10.787）的研究成果，以小鼠（结肠组织）为研究对象，通过空间代谢组学质谱成像等研究技术，全面探究环硝基氧化物MetT对DSS诱导结肠炎的改善作用，并发现其通过抑制氧化损伤，减少单核细胞募集和衰减MPO活性等机制发挥作用，为后续辅助疗法开发和应用提供了理论基础。

研究背景

炎症性肠炎（IBD）作为一种累及回肠、直肠、结肠的慢性肠道炎症性疾病。现有研究显示，IBD患者的髓过氧化物酶（MPO）水平显著升高并与疾病严重程度相关。MPO主要表达在肠道粘膜的浸润的中性粒细胞之中，能够消耗过氧化氢（H2O2）进而氧化氯离子（Cl-）产生次氯酸（HOCl）。次氯酸作为一种强大的双电子氧化剂，能够破坏组织并在细胞招募中发挥作用，从而促进IBD的氧化应急和炎症损伤。因此，靶向MPO/ H2O2/卤化物介导的氧化损伤途径可能作为调节和治疗IBD炎症的有效策略。

环状氮氧化物是一类具有抗氧化活性的自由基，表现出超氧化物歧化酶和过氧化氢酶样活性，从而清除细胞中的反应性氧化剂。此外，环状氮氧化物作为MPO的底物，也是MPO/ H2O2/卤化物途径的有效抑制剂，能够抑制病理性活性氧（ROS）的积累。前期研究表明，环状硝基氧化物在动物模型中显示出与预防胃肠道损伤相关的抗炎和抗氧化活性，并在生物体内也具有良好的耐受性，然而其在调节与IBD相关的炎症和MPO/ H2O2/卤化物诱导的损伤的潜力尚未得到专门研究。在本研究中，研究人员对一种环状硝基氧化物4-甲氧基-TEMPO（MetT）在实验性IBD模型上的抗氧化和抗炎潜力和效应机制进行深入分析。

研究思路

研究方法

1. 实验分组

（1）研究材料

野生C57BL/6小鼠（每组 n =6，雌性，8~9周）

正常对照组（V）：10% v/v DMSO+90% v/v磷酸盐缓冲盐水
MetT对照组（MetT）：正常对照组通过静脉注射15 mg/kg MetT
DSS处理组：3% w/v葡聚糖硫酸钠（DSS）处理9天
DSS+MetT组：DSS组通过静脉注射15 mg/kg MetT

（2）生理指标

小鼠体重
临床评分：基于活动性降低、粪便稠度和直肠出血
细胞浸润水平：InForm软件

2. 生化分析

鲁米诺氧化水平测定：MPO、HRP 或 Mb组
生化检测：结肠组织裂解液
促炎因子的酶联免疫吸附测定（ELISA）：IL-6，IL-10
氧化损伤指标：谷胱甘肽磺酰胺，3-氯酪氨酸，血清脂质过氧化氢（LOOH）

3. 组织染色

多色免疫组化：F4/80，Ly6C，MPO
免疫组化：粘蛋白，3-硝基酪氨酸
TUNEL细胞的免疫荧光染色

4. 检测技术

质谱成像：空间代谢组学
氧化鲁米诺的体内成像：IVIS® SpectrumCT体内成像系统

研究结果

1. MetT改善接受DSS处理的小鼠临床参数 | 药物疗效

在小鼠体重变化方面，在DSS损伤的第9天，MetT和载体对照中两组之间没有显著的体重变化，而单独用DSS处理的小鼠体重相对于载体对照组小鼠平均减少14%。在同一时间点，DSS+MetT组相比DSS组的小鼠显示出体重减轻程度有所显著减少（8%，p<0.05）。

在结肠炎特征得分方面。载体对照组和MetT组中的小鼠在第9天没有可测量的临床评分（图1b）。DSS组小鼠在第9天的临床评分增加（p<0.05）。相比之下，与DSS+MetT组小鼠显示出改善的临床评分（降低〜45%；p<0.05）。在隐窝含量方面，与载体对照组相比，用DSS治疗9天的小鼠显示出隐窝数量（~422）的显著减少。然而，与从载体对照DSS处理的小鼠获得的肠道样本相比，DSS+MetT组中小鼠显示出显著更高的隐窝含量（图1c）。

在杯状细胞数量方面，与对照组相比，粘蛋白的免疫组化染色结果显示其DSS组小鼠结肠中显著减少，而DSS刺激的粘蛋白减少在DSS+MetT组小鼠中明显有所缓解（图1d）。另外与对照组小鼠相比，DSS处理组沿横结肠和降结肠长度的粘蛋白水平显著降低（下降了约11倍）。相比之下，在DSS+MetT组小鼠中，粘蛋白染色仅减少了约2倍，表明MetT在实验性结肠炎过程中保留了隐窝和结肠上皮的完整性（图1e）。

图1 | MetT可减轻DSS处理小鼠的体重减轻以及临床和组织病理学参数

2. MetT被机体吸收并定位在结肠中 | 药物分布

采用质谱成像空间代谢组学技术对来自DSS和DSS+MetT处理的小鼠的新鲜冷冻结肠进行药物空间分布分析（图2）。结果显示MetT亲本离子（186 Da，正电荷）定位于接受DSS+MetT的小鼠的结肠组织区域中，而在单独接受DSS处理的小鼠中基本不存在，表明MetT在小鼠的结肠组织区域中积累。

图2 | 空间代谢组学检测MetT在DSS处理小鼠结肠中的空间分布

3. MetT改善DSS诱导的蛋白质氧化修饰 | 抗氧化活性

体外实验表明，与没有NaCl相比（〜1400辐射度），MPO+NaCl组中显著增加了HOCl的底物—鲁米诺的氧化水平，其发光信号约〜3800辐射度（图3a），并强于辣根过氧化物酶（HRP，低活性）以及肌红蛋白（Mb，无活性）的信号水平。而在NaCl存在下，滴定硝基氧化物MetT能够抑制MPO酶活性从而降低了鲁米诺氧化水平，并呈现对MetT的剂量依赖性抑制（图3b，c）。

图3 | MetT抑制MPO / HOCl介导的鲁米诺的氧化水平

在谷胱甘肽磺胺（GSA）水平方面。与对照组相比，DSS处理组小鼠的GSA水平显著增加，然而DSS+MetT组中的GSA水平与单独使用DSS相比没有显著变化（图4a）。而与对照组相比，3-氯酪氨酸（3-Cl-Tyr）在DSS处理的小鼠中显著增加，并且在DSS+MetT小鼠中显著降低至基线水平以下（图4b，d和e）。表明硝基氧化物MetT能够缓解结肠中MPO /HOCl特异性蛋白质损伤，但不能抑制GSA的氧化修饰。在DSS诱导的结肠炎中，循环脂质过氧化氢（LOOH）水平与对照组相比显著增加了约1.5倍，而在DSS+MetT做中恢复至基线水平，表明MetT在DSS处理组小鼠中被全身吸收并增强整体的抗氧化状态（图4c）。

图4 | MetT降低结肠组织中MPO介导氧化损伤的生物标志物水平

研究进一步验证MetT在体内减弱HOCl介导的氧化修饰，研究分析不同组别中的鲁米诺氧化的生物发光水平。其中，载体对照组小鼠的腹部生物发光很低（总辐射值为〜5），而DSS处理组小鼠发光水平为〜30。与单独使用DSS相比，DSS+MetT组小鼠中的腹部生物发光信号降低（p = 0.053; 图 5a 和 b）。该结果表明MetT能够抑制MPO介导的氧化活性从而降低MPO/HOCl介导的鲁米诺氧化水平。

图5 | 在对照组，DSS处理组和DSS+MetT组的小鼠中鲁米诺氧化的体内生物发光成像

4. MetT改善DSS诱导的结肠炎的免疫细胞浸润 | 免疫浸润抑制

与载体组或单独用MetT处理的小鼠相比，DSS处理组和DSS+MetT组小鼠的总细胞浸润水平显著增加，然而MetT给药显著降低DSS介导的细胞浸润程度（图6a）。总体而言，在DSS诱导的结肠炎过程中，免疫细胞MPO+信号强度显著增加，并且在MetT给药后减弱至接近基线水平（图6b）。而相关性分析表明隐窝完整性与MPO水平呈负相关（p = 0.011，图6c），表明MPO对隐窝有不利影响，并且MetT对于隐窝完整性的维持可能是通过其对MPO的抑制作用来介导的，从而改善小鼠DSS诱导的免疫细胞趋化性。

图6 | MetT处理发炎结肠组织中的组织结构和免疫组织化学分析

为了鉴定发炎结肠中浸润细胞群表型，在结肠粘膜对Ly6C单核细胞（红色），Ly6G嗜中性粒细胞（橙色）和F4 / 80巨噬细胞（绿色）进行定量。并与MPO共同标记以评估结肠MPO的主要来源。其中单核细胞显示出最高水平的MPO共染色（分别为图7a-d，e-h和i-l）。与没有DSS处理的小鼠相比，DSS诱导的结肠炎导致单核细胞，中性粒细胞和巨噬细胞在募集到发炎的结肠组织中（分别为图7m，n和o）。在DSS+MetT组中显著减弱了招募到发炎结肠的单核细胞数量，然而，巨噬细胞和中性粒细胞募集的水平保持不变。这些数据表明，MetT在DSS诱导的结肠炎中改善了免疫细胞浸润，特别是单核细胞的募集，并且该效应与MPO降低相关，并进一步表明MetT在该动物模型中表现出与抗氧化活性协同作用的抗炎活性。

图7 | MetT处理发炎结肠组织中的单核细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞与MPO共同标记分析

研究进一步分析MetT在DSS诱导的结肠炎期间是否改变了结肠组织的免疫学特征，在抗炎细胞因子IL-10和促炎细胞因子IL-6的水平水平方面。与对照组相比，DSS组和DSS+MetT组的IL-10显著下调（图8a），而IL-6显著增加（图8b），表明MetT并没有明显影响结肠IL-10和IL-6的水平，其调控作用可能是一种非免疫调节途径，对MetT的保护作用可能归因于其抗氧化活性。

图8 | MetT处理发炎结肠组织中的细胞因子IL-10和IL-6表达水平定量

5. MetT可消除结肠炎中DSS介导的细胞死亡 | 细胞死亡改善

为探究急性结肠炎期间的细胞死亡特征，本文接着通过结肠组织样品中的TUNEL方法检测细胞死亡。发现对照组中的结肠TUNEL标记（绿色）很少，而DSS处理的小鼠的结肠中TUNEL标记显著增加。而与DSS处理组的小鼠相比，DSS+MetT组的小鼠显示出显著降低的TUNEL标记水平，并与对照组相当（图9a和b）。

图9 | MetT处理发炎结肠组织中TUNEL的免疫荧光图像和定量

相关讨论

尽管目前缺乏明确IBD的直接病因，但黏膜损伤和上皮损伤先于影响肠道微生物群的炎症性损伤，导致特征性中性粒细胞浸润至粘膜下层，随后通过活化的MPO和生成HOCl从而产生ROS，导致能够对硫醇，脂质和DNA进行不可逆氧化，最终导致细胞死亡。本研究中观察到活体动物中DSS +MetT处理的小鼠中MPO介导的鲁米诺氧化显著减弱，以及MPO产生的HOCl的特定标志物—3-Cl-Tyr水平完全消亡，表明MetT能够直接抑制MPO卤化活性。本研究中的数据也表明，MetT能够消除在急性结肠炎模型中氧化应激介导的细胞死亡。与其他环状硝基氧化物的研究相比，本文深入探讨环状氮氧化物是否在体内抑制MPO活性的重要问题，进一步突出环状硝基氧化物在体内的抗氧化作用。

本研究还证明了MetT给药调节免疫细胞在发炎结肠中的各个组织学区域的募集。其中巨噬细胞分布主要局限于固有层，取代了DSS处理的小鼠的隐窝结构。目前尚不清楚 MetT 是否在结肠炎期间直接抑制巨噬细胞对固有层的趋化性，或者 MetT 是否保留了隐窝完整性从而限制了巨噬细胞浸润。虽然之前的体外报告显示，在硝基氧化物治疗期间中性粒细胞募集减少，但在MetT治疗的结肠炎模型中，并没有观察到体内中性粒细胞募集的调节。相反，我们报告在MetT治疗期间，发炎结肠的单核细胞募集显著减少。因此，局部MPO卤化活性的降低也可以归因于含有MPO的其他白细胞（例如单核细胞）的募集减少。

研究结论

本研究结果发现：

与单独接受DSS的小鼠相比，用4-甲氧基-TEMPO（MetT）治疗的小鼠的体重，临床评分，粘蛋白水平和隐窝健康状况等指标显著改善。基于结肠切片的空间代谢组学质谱成像结果表明MetT在结肠中积累，并通过抑制结肠中的MPO / HOCl活性和氧化等生物标志物的组合显著改善实验性结肠炎病程。

MetT还通过促进细胞存活来恢复结肠组织结构，通过一种非免疫调节途径，抑制免疫细胞渗透到肠道层的程度。基于鲁米诺的活体动物小鼠成像也显示，在用MetT预处理的小鼠中，腹部生物发光显著衰减，与MPO抑制一致，从而产生对结肠的氧化损伤的衰减。总体而言，硝基氧化物MetT在小鼠中具有良好的耐受性，并有效抑制了DSS刺激的急性结肠炎。

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结肠炎期间的MPO卤化途径激活会导致宿主组织损伤并加剧炎症。而环状氮氧化物作为MPO抑制剂，具有强大的抗炎和抗氧化能力。本研究围绕DSS诱导结肠炎的各类临床和生化指标，同时也采用了空间代谢组学的技术，全面探究环硝基氧化物MetT对结肠炎的改善作用，并发现其通过抑制氧化损伤，减少单核细胞募集和衰减MPO活性等机制发挥作用。总体而言，该研究突出了环状氮氧化物的治疗潜力，为类似研究提供新颖见解。其严谨的实验思路和详实的研究结果，值得广大读者进行借鉴和参考。

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参考文献

1.Chami, Belal et al. “The nitroxide 4-methoxy-tempo inhibits the pathogenesis of dextran sodium sulfate-stimulated experimental colitis.” Redox biology vol. 28 (2020): 101333. doi:10.1016/j.redox.2019.101333

2. Alex, Philip et al. “Distinct cytokine patterns identified from multiplex profiles of murine DSS and TNBS-induced colitis.” Inflammatory bowel diseases vol. 15,3 (2009): 341-52. doi:10.1002/ibd.20753

3. Augusto, Ohara et al. “Cyclic nitroxides inhibit the toxicity of nitric oxide-derived oxidants: mechanisms and implications.” Anais da Academia Brasileira de Ciencias vol. 80,1 (2008): 179-89. doi:10.1590/s0001-37652008000100013

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Nino|撰文

小久|排版

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