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产品介绍|蛋白质组学高质量标准品

氨探生物

2023.7.14

背景介绍

BACKGROUND

293T细胞是在293细胞的基础上通过转染携带T抗原的质粒得到的细胞系，其主要特点是在转染过程中易于产生高效的转染，因此广泛应用于基因转染和表达实验中。293T蛋白消化标准品是一种经过高度验证的哺乳动物蛋白消化物，可用作复杂蛋白质组学样品的质谱 (MS) 分析的质控样品。在分析复杂样品之前经常采用消化物标准品可随时间监测和标准化样品间的 LC/MS 性能。

氨探生物出品了293T蛋白消化标准品，该蛋白消化标准品是一种冻干的胰蛋白酶肽混合物，可用作液相色谱(LC)分离、MS方法开发和MS性能基准测试的质量控制标准。该消化物专为LC/MS 实验而配制，不含盐或去污剂。

293T蛋白消化标准品的特点包括：

• 阳性对照: 人肾上皮细胞系的蛋白质酶切产物，总蛋白质数超过15,000种；

• 彻底酶切: 使用LysC和Trypsin制备，以确保漏切肽段比例小于10%；

• 经验证的肽质量: 低于10%的蛋氨酸氧化和赖氨酸氨甲酰化；

• 严格检测: 高质量、一致的蛋白酶切，批次特定的检验报告；

• 稳定: 以稳定的冻干形式提供。

实验步骤流程图

•细胞裂解：293T细胞沉淀在裂解液中裂解；

•蛋白消化：通过还原/烷基化半胱氨酸方法(carbamidomethylation, + 57.02)与混合蛋白酶组合使用酶切蛋白，使蛋白消化更完全，从而得到多肽；

•肽段脱盐：使用填充有具有阳离子交换作用的固相萃取板进行肽段脱盐；

•质谱检测：运用高分辨质谱Q Exactive HF-X Orbitrap质谱仪选用数据依赖型采集（DDA）方式采集数据。

图1. 实验步骤流程图

数据处理方法

• 质谱检测条件

液相：肽段通过U3000RSLC nano系统（Thermo Scientific, USA）分离；取约500 ng肽段上样到C18分析柱（1.9 μm, 100 Å, 75 μm i.d. × 18 cm，氨探生物）分离。流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的80%乙腈；在1-32%的分离梯度下，流速为300 nL/min。柱温55 ℃，梯度65 min。

质谱：Thermo Scientific™ Q Exactive HF-X Orbitrap™质谱仪上选用数据依赖型采集（DDA）方式采集数据；质谱全扫分辨率为60,000 @ m/z 200，AGC为3E6，最大离子进样时间20 ms，扫描范围m/z 350-1200，标准化碰撞能量为27%，二级质谱扫描分辨率为15,000 @ m/z 200，扫描范围为m/z 200-2000，AGC为1E6，最大离子进样时间为45 ms，动态排除时间为40s，电荷价态选择2+-8+。

• 搜库参数

基于人类Swissport蛋白数据库通过Proteome Discoverer v2.4 (Thermo Scientific, USA)获取肽段和蛋白含量数据；PD软件设置查库相关参数：Digest Rule: Trypsin; Max Missed Cleavages: 2; Precoursor Mass Tolerance: 10 ppm; Fragment Mass Tolerance: 0.02Da; Static modifications: Carbamidomethyl (C); Dynamic modifications: Oxidation (M); FDR for Protein and peptide ≤ 0.01；肽段漏切比例，还原烷基化比例，氧化比例和变性比例数据统计，使用pfind3.0默认参数检索。

• 质控参数

表1. 293T酶切肽段质控参数

参数	质控要求	实验结果	结果
肽段BCA定量	浓度 1µg/µL	浓度=1.0 µg/µL	pass
LC-MS TIC图	LC-MS图与下图对照一致	LC-MS图与下图对照一致	pass
肽段鉴定数目	肽段数目 ≥ 18000	肽段数目 = 21598	pass
蛋白鉴定数目	蛋白数目 ≥ 3800	蛋白数目 = 4366	pass
全酶切肽段比例	全胰蛋白酶切≥ 85 %	全胰蛋白酶切= 92%	pass
Cys还原烷基化肽段比例	半胱氨酸还原烷基化 ≥ 12%	半胱氨酸还原烷基化= 15.96%	pass
Oxidiation肽段比例	甲硫氨酸氧化 ≤ 10 %	甲硫氨酸氧化= 2.07%	pass
Deamidation肽段比例	脱酰胺 ≤ 5 %	天冬酰胺氧化 = 0.91%	pass

* Peptide missed cleavage, alkylation, oxidation and modification determined by Preview™ Software (Protein Metrics) using a human protein Swiss-Prot database.

图2. 293T蛋白质酶切肽段在Q Exactive HF-X 质谱仪上经过60 min鉴定得到的Base peak

总结

氨探生物出品的293T蛋白消化标准品，基于Q Exactive HF-X质谱，进样500 ng，选用数据依赖型采集（DDA）方式60分钟梯度采集数据，运用人类Swissport蛋白数据库通过Proteome Discoverer v2.4 (Thermo Scientific, USA)获取肽段和蛋白含量数据，鉴定到21,598个肽段，4366个蛋白，且胰蛋白酶肽漏切比例小于10%，同时非特异性修饰较少。

293T细胞裂解物通过LysC和胰蛋白酶进行酶切，可以尽量减少胰蛋白酶缺失裂解并改善蛋白序列覆盖率。此外，与用于质谱的其他市售蛋白消化标准品不同，293T蛋白消化标准品可满足严格的质量检测规范，包括肽质量、酶切效率和消化物批次间的均匀性。

若您对我们的产品感兴趣，或有宝贵的意见和建议，请联系我们:info@untangledbio.com。

参考文献

1.Paulo JA, O''Connell JD, Gygi SP.A Triple Knockout (TKO) Proteomics Standard for Diagnosing Ion Interference in Isobaric Labeling Experiments.J Am Soc Mass Spectrom.2016 10:1620-5.

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3.Kelstrup, C. D.; Jersie-Christensen, R. R.; Batth, T. S.; Arrey, T. N.; Kuehn, A.; Kellmann, M.; Olsen, J. V., Rapid and Deep Proteomes by Faster Sequencing on a Benchtop Quadrupole Ultra-High-Field Orbitrap Mass Spectrometer. J Proteome Res 2014.

4.Rosenberger, G.; Koh, C. C.; Guo, T.; Röst, H. L.; Kouvonen, P.; Collins, B. C.; Heusel, M.; Liu, Y.; Caron, E.; Vichalkovski, A.; Faini, M.; Schubert, O. T.; Faridi, P.; Ebhardt, H. A.; Matondo, M.; Lam, H.; Bader, S. L.; Campbell, D. S.; Deutsch, E. W.; Moritz, R. L.; Tate, S.; Aebersold, R., A repository of assays to quantify 10,000 human proteins by SWATH-MS. Scientific Data 2014, 1, 140031.

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