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高质量代谢组学实验标准品

氨探生物

2023.8.14

背景介绍

BACKGROUND

人血浆代谢组标准品是一种经过严格质量控制验证的人血浆提取代谢混合物，可用作复杂非靶向代谢组学和靶向代谢组学项目质谱 (MS) 分析的质控样品。在分析正式样品之前采用代谢组标准品可随时间监测和标准化样品间的 LC/MS 性能。

氨探生物出品了人血浆代谢组标准品，该代谢组标准品是一种冻干的人血浆提取代谢混合物，可用作液相色谱 (LC) 分离、MS 方法开发和 MS 性能基准测试的质量控制标准。该标准品专为非靶向代谢组学和靶向代谢组学实验而配制，同时含有8种特定浓度的稳定同位素重标。

人血浆代谢组标准品的特点

• 阳性对照样品：来自健康人血浆样品的代谢组提取物（>2,000 种二级质谱匹配成功的代谢物）；

• 自动化提取流程：使用自动化工作站进行代谢组样品的制备过程，以确保同批次产品的稳定性和重现性；

• 同位素重标：每份产品中都包含8种特定浓度的同位素内标，可用于产品质控，也可用于后期进行绝对定量分析（表1）；

• 严格质检：保证高质量、一致的代谢物提取流程和多重质量控制流程，通过批次特定的检验报告予以记录；

• 稳定：以冻干形式低温保存。

表1. 人血浆代谢组标准品中同位素内标信息表

	同位素内标	内标类别	[M+H]⁺	[M-H]^-	浓度
代谢组质控内标	L-Lysine-d4	Amino acids	151.1379	149.1234	50µM
	Citric acid d4	Organic acids	197.0594	195.0448	100µM
	Succinic acid-d4	Organic acids	123.0590	121.0444	100µM
	Benzoic acid d5	Benzene	128.0754	126.0609	50µM
	D-Fructose-13C6	Carbohydrates	187.0908	185.0762	50µM
	5-HIAA-d5	Indole	197.0969	195.0824	20µM
	N-benzoyl-D-phenylalanine	Others	270.1125	268.0979	2µM
	DNOP-d4	Others	395.3094	393.2948	4µM

标准品生产流程

· 样品收集：收集健康人献血血浆样品。

· 代谢组标准品生产：通过标准的代谢组学前处理方法提取出人血浆中代谢组成分，并使用固相沉淀板进行蛋白成分和微小颗粒的去除，保证代谢组标准品的洁净程度。

· 代谢组标准品保存：使用低温浓缩仪将代谢组标准品溶液进行冻干，将代谢组标准品冻干粉保存于-80℃冰箱中，等待质检（图1）。

图1. 标准品生产和质控流程图

标准品质控流程

· 高分辨质谱质检：RPLC和HILIC两种分离模式结合高分辨质谱Q Exactive HF-X Orbitrap质谱仪选用数据依赖型采集（DDA）方式采集质控数据。

· 数据检索：质谱数据通过Coumpound Discoverer v3.2进行峰匹配

· 质控参数：获取一级、二级谱图数量、有效特征峰信息、多重内标保留时间和含量信息，与质控参数阈值进行比对，判断生产标准品合格程度（表2）。

表2. 代谢组标准品质控参数表

参数	质控要求	实验结果	结果
一级谱图数目	RPLC：spectra数目 ≥ 15,000	spectra数目 = 16,112	pass
一级谱图数目	HILIC：spectra数目 ≥ 10,000	spectra数目 = 10,166	pass
二级谱图数目	RPLC：spectra数目 ≥ 2,500	spectra数目 = 2,757	pass
二级谱图数目	HILIC：spectra数目 ≥ 1,200	spectra数目 = 1,393	pass
有效特征峰数目	RPLC：Feature数目 ≥ 1,500	Feature数目 = 1,723	pass
有效特征峰数目	HILIC：Feature数目 ≥ 800	Feature数目 = 947	pass
稳定同位素内标	RPLC：5种同位素内标，Intensity ≥ 1E6	RPLC：5种同位素内标，Intensity ≥ 1E6	pass
稳定同位素内标	HILIC：3种同位素内标，Intensity ≥ 1E5	HILIC：3种同位素内标，Intensity ≥1E5	pass

重现性评价

随机选取三份代谢组标准品按照说明书选择特定体积的复溶溶剂进行冻干产品的复溶，然后在高分辨质谱上进行了三次检测以评估标准品生产流程的可重复性。如下图2A-B-C所示，三次重复检测出的一级质谱图谱数量分别为16,550(RPLC⁺)、10,089(HILIC⁺)种，二级质谱图谱数量分别为2,722(RPLC⁺)、1,234(HILIC⁺)种，注释匹配有效特征峰数量分别为1,750(RPLC⁺)、940(HILIC⁺)种；代谢分子定量强度的中位RSD为10%，表明该标准品具有很好的一致性（图2D）。

图2. 代谢组标准品在三次检测中的重现性结果

（A）RPLC、HILIC分离体系下正负离子模式检测得到的一级谱图数量；（B）RPLC、HILIC分离体系下正负离子模式检测得到的二级谱图数量；（C）RPLC、HILIC分离体系下正负离子模式检测得到的有效特征峰数量；（D）定量代谢分子强度的RSD箱线图。

总结

氨探生物生产的人血浆代谢组标准品，采用高度重现的样品前处理方法和严格的质控标准，确保样品的均匀性和重现性；添加的8种同位素重标，用于快速质控，也可用于绝对定量分析。期待该标准品能为非靶向代谢组学和靶向代谢组学实验提供可靠的质控方法。

若您对我们的产品感兴趣，或有宝贵的意见和建议，请联系我们：info@untangledbio.com。

参考文献

1. Genomic atlas of the plasma metabolome prioritizes metabolites implicated in human diseases. Nat Genet 55, 44–53 (2023).

2. Small molecule metabolites: discovery of biomarkers and therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther 8, 132 (2023).

3. Analytical Methods for Mass Spectrometry-Based Metabolomics Studies. Adv Exp Med Biol 11, 40:635-647(2019).

4. Mass spectrometry-based metabolomics for an in-depth questioning of human health. Adv Clin Chem 99, 147-191(2020).

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