作者:保志娟，杨雪琼，丁中涛，曹秋娥，邹永明
摘要：使用pH=8.93的KH2PO4-NaOH缓冲液(0.025mol/L)，根据混合物含量测定的原理，在289.4nm和316.4nm处测定溶液吸光度来测定厚朴酚与和厚朴酚的含量，在517nm处考察厚朴酚与和厚朴酚清除DPPH·的活性，建立了同时测定厚朴酚与和厚朴酚含量的紫外分光光度法，初步考察了二者的自由基清除活性。DPPH·可作为二者抗氧化活性的研究方法。
厚朴酚(magnolo1)与和厚朴酚(honokio1)是木兰科植物厚朴、大叶木兰树皮及洋玉兰种子中的主要活性成分，广泛地用于临床治疗，主要有肌肉松弛、抗菌、抗炎、抑制胃溃疡和防止应激性胃功能障碍、抑制血小板聚集、中枢神经系统保护和降血压等作用，最近的研究指出厚朴酚与和厚朴酚还具有抑制癌细胞的作用。目前用于定量测定厚朴酚与和厚朴酚的方法主要是薄层扫描法、高效液相色谱法和毛细管区带电泳法。用紫外分光光度法同时分别测定厚朴酚及和厚朴酚尚未见报道。
在中性溶液中，厚朴酚与和厚朴酚的紫外吸收基本一致。本文利用它们羟基质子离解性(pKa)的差异 ，在一定浓度的样品液中加入缓冲溶液，使厚朴酚离解而和厚朴酚不离解，从而使厚朴酚的最大吸收峰发生红移，这样二者的最大吸收峰不再重合。在含有多种吸光物质的溶液中，由于各吸光物质对某一波长的单色光均有吸收作用，如果各吸光物质的吸光质点之间相互不发生化学反应，当某一波长的单色光通过这样一种含多种吸光物质的溶液时，溶液的总吸光度应等于各吸光物质的吸光度之和。据此，可以进行多组分的分析测定。对于二元组分混合物的分别测定，可解联立方程式。由此建立了厚朴酚与和厚朴酚同时测定的紫外分光光度法，并应用于三种中成药：香砂平胃散、藿香正气水和保剂丸中厚朴酚及和厚朴酚的含量测定。同时还研究了厚朴酚与和厚朴酚清除DPPH·的活性。
1 仪器与试剂
UV-PC-2401型紫外分光光度仪(日本岛津公司)，pHS-2C型精密pH计。厚朴酚及和厚朴酚纯品(从长缘厚朴中分离得到，HPLC纯化)，无水乙醇、KH2PO4、NH4Cl、NaOH、Na2B4O7.10H20均为分析纯试剂，香砂平胃散((昆明天紫红制药厂)、藿香正气水(云南腾冲制药厂)、保剂丸(广州羊城药业股份有限公司)均为市售药品。
标准溶液：取厚朴酚与和厚朴酚纯品，50%乙醇及无水乙醇分别配制成1.00×10mol/L的溶液。
DPPH·(1，1-Dipheny1-2-piclhydrazyl radica1)(日本东京化成工业株氏会社)，用无水乙醇(国产A.R.级试剂)为溶剂，超声溶解后，将其配制成浓度为2.00×0.0001mol/L的储备液，密封于冰箱存放，用时将储备液稀释。
2 样品处理方法
参照文献5对药品进行处理。准确称取香砂平胃散8.0600 g，加入25mL无水乙醇回流1.5 h，冷却至室温过滤，沉淀用少量无水乙醇洗涤后再过滤，滤液合并蒸干。残渣用7mL Na0H(1mol/L)溶解，用20mL石油醚萃取两次。水层用Ha调pH=2～3，用30，30，20，20，20mL CHCl3萃取，用蒸馏水20mL清洗CHCI3萃取液至中性，水层再用20mL CHCl3萃取，合并CHCl3层用无水Na2SO4干燥后蒸干。残渣用无水乙醇溶解定容至25mL，再精密吸取1.0 mL该液用50%乙醇定容为25mL，滤膜过滤后作为无色待测液。
保剂丸(粉末2.0067g)和藿香正气水(10mL)的处理方法与香砂平胃散类似，只是保剂丸残渣直接用50%乙醇定容为100mL，再精密吸取15.0mL定容为25mL过滤待用;藿香正气水则不需回流，加热先除去乙醇后，再按前述方法处理，直接用50%乙醇液定容至25mL过滤待用。
3 方法与结果
3.1 缓冲体系及用量选择 ，
配制不同pH值的Na2B407-HCl、KH2PO4-NaOH、NHCl-NH3·H2O缓冲液。分别取厚朴酚标液2.5 mL，加入上述缓冲液各5.0 mL，用蒸馏水定容至25 mL，摇匀，以蒸馏水为参比进行UV测定。由于KH2PO4-NaOH体系的干扰小，且样品峰型好，故实验选择该缓冲体系。其它条件不变，改变缓冲液用量，结果表明用量在4.0～8.0 mL间吸光度稳定且峰形良好，故选择合适体积为5.0 mL。
3.2 测定pH值的选择
取5mL相同浓度不同pH值的KH2PO4-NaOH缓冲液，加入厚朴酚或和厚朴酚标液2.5mL定容为25mL，测定最大吸收峰。结果显示在pH值8.08～9.44范围内，厚朴酚已经离解，其最大吸收峰红移到316.4nm，而和厚朴酚还未离解，其最大吸收峰还在289.4nm处，故我们选择pH=8.93的KH2PO4-NaOH缓冲液。
3.3 稳定性研究及乙醇用量影响
厚朴酚及和厚朴酚标液各取2.5mL，加入pH=8.93的KH2PO4-NaOH缓冲液5.0 mL，定容至25mL，放置5，10，30min，1h，2h测定最大吸收峰的吸光度。结果显示放置时间超过2h后，吸光度略有下降，在1h内，样品稳定，吸光度几乎不变。由于在标样及试样溶液中，用到了无水乙醇，为此考察了乙醇用量的影响。从测定结果看，加入乙醇会增加吸光度，但增加的量很小，考虑到乙醇的挥发性，故不加入更多的乙醇，以防止测定误差增大。
3.4 标准曲线
精度取厚朴酚及和厚朴酚标液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL于25mL比色管中，加入pH=8.93的KH2PO4-NaOH缓冲液5.0mL，蒸馏水定容为25mL，在289.4nm，316.4nm的波长下测定吸光度。以吸光度值A对浓度C进行线性回归(SPSS软件计算)，厚朴酚的标准曲线为A316.4=7500.000C+0.08529(R=0.999，RSD=0.00748)，A289.4=4221.429C+0.103(R=1.000，RSD=0.00362)。和厚朴酚的标准曲线为A316.4=666.071C+0.07589(R=0.998，RSD=0.00155)，A289.4=6939.286C+0.106(R=1.000，RSD=0.00536)。厚朴酚及和厚朴酚在1.00×0.00001～3.00×0.0001mol/L(2.667～79.8μg/mL)范围内呈线性关系。
3.5 样品测定方法和可行性
分别取香砂平胃散待测液1.5 mL，藿香正气水、保剂丸待测液1mL，加入5mL pH=8.93的KH2PO4-NaOH缓冲液5mL，定容为25mL，平行测定三次，求样品含量。并按照3.6项下方法求算回收率。由标准溶液可求出厚朴酚与和厚朴酚在316.4m和289.4nm处的摩尔吸光系数ε，根据A316 4(总)= ε316.4(厚朴酚)·C(厚朴酚)+ ε316.4(和厚朴酚)·C(和厚朴酚)A289. 4(总)= ε289.4(厚朴酚)·C(厚朴酚)+ ε289.4(和厚朴酚)·C(和厚朴酚)可计算出厚朴酚与和厚朴酚的含量。
在一份溶液中加入与样品含量相近的厚朴酚与和厚朴酚纯品，扫描紫外图谱。结果显示，在270nm～350 nm范围内，厚朴酚与和厚朴酚纯品混合液与样品的紫外吸收的峰形相似，且吸光度相近。因而可判断样品用该法测定是可行的，样品中的其它物质在测定条件下基本不干扰。
3.6 加样回收率
取已知浓度5份待测液加入1.0 mL厚朴酚及0.5 mL和厚朴酚标液，另外一份做空白。各份按照标准样品测定的方法，加入缓冲液并定容到25mL，在289.4，316.4 rim处测定吸光度，求均值，计算相对加样回收率。
3.7 活性研究
1，1-二苯基-2-苦味肼基自由基(DPPH·)法可作为初步抗氧化活性研究。DPPH·的乙醇溶液为深紫色，其最大波长在517nm处。当加入清除活性物质，DPPH·的溶液将会褪色。其褪色程度与自由基清除剂的含量成化学计量关系，可用分光光度法进行测定。我们取2.0 mL DPPH·溶液，加入不同体积的厚朴酚与和厚朴酚无水乙醇溶液，用无水乙醇定容为5mL，放置30min后，在517nm处，迅速测定A517根据公式计算其抑制率。抑制率=[( A0一Ai)/A0 ]×100%
A0—2.0mL DPPH·溶液定容为5mL的吸光度。
Ai—2.0 mL DPPH·溶液加入样品溶液，定容为5mL的吸光度。
厚朴酚比和厚朴酚的活性弱，还没达到IC50时，曲线就趋于平缓。在含量为4×0.000001mol时，和厚朴酚的抑制率为49.82%，而厚朴酚的抑制率仅为10.57%。作为对照物的芦丁在该含量下，抑制率为92.0%。与之相比，厚朴酚与和厚朴酚的活性都较弱。
4 讨论
从测定的结果来看，不同药品的厚朴酚与和厚朴酚含量差别较大，可能与药材来源、制剂和生产工艺的差异有关。此外用光度法测定二者的含量，预处理工作很重要，反复提取纯化可以避免多种物质干扰。本文建立的利用二者pKa差异，通过调节测定pH值，使二者的紫外光谱出现不同，利用同一波长下，吸光度的加和性，从而同时测定厚朴酚及和厚朴酚的紫外分光光度法，与其它文献方法相比，具有操作快速、简便、准确及成本低等优点，为一些含有厚朴酚及和厚朴酚的药品生产和质量监控提供了一种切实可行的分析方法。
此外，我们的研究表明，厚朴酚与和厚朴酚具有清除DPPH·活性，这是前人没有报道过的。它们的测定结果从另外一方面证实了它们具有抗氧化活性。
参考文献
1 国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分手册第一版.北京：人民卫生出版社，1996.527—528，693—694
2 陆冬莲，张尊听，刘谦光，等.太白山区23种中草药抗氧化活性的研究.天然产物研究与开发，2001，13(4)：20—22
3 王桂芳，张守尧，雷正杰，等.毛细管区带电泳法测定厚朴药材及其超临界流体萃取物中厚朴酚、和厚朴酚的含量.中国药学杂志，2001，36(4)：265—267