体积排阻与分子烙印聚合物结合的高选择性生物样品固相萃取技术

在分析复杂生物样品(如血浆、血清及尿液)的过程中，常常设计一个样品预处理步骤，用来除去大量基体组分并富集所要的被分析组分。目前，固相萃取(SPE)是处理此类样品的首选，但SPE是一个冗长的过程，其成败决定于对样品合适的萃取材料。近来，一类被称为分子烙印聚合物的新型SPE材料，由于其特殊的选择性，在分离领域越来越引人注目。

The analysis of complex biological samples, such as serum, plasma, and urine, generally involves a sample preparation step designed to remove many of the matrix components and enrich the analyte(s) of interest. Currently, solid-phase extraction (SPE) is the method of choice for samples of this kind, but SPE can be a lengthy process and its success is determined by the availability of suitable extraction materials for the sample in question. Recently, a new kind of SPE material called molecular imprinted polymers has become increasingly attractive in the separation sciences because of their tailor-made selectivity.

      固相萃取(SPE)是一种目前占主导地位的样品净化技术，不同类型、不同规格的一次性SPE预装柱管已商品化。通过恰当选择固定相、清洗及洗脱溶剂的类型，可使不同种类的化合物从复杂基体中分离出来，从而简化了后续的色谱分离和定性过程。由于传统的SPE方法涉及多步操作，费时、费力，且选择性差，易出差错，因此，在选择性／专一性的SPE吸附剂基础上，发展新型、高效、自动化的样品净化技术是人们所感兴趣的研究课题。

1分子烙印聚合物

　　被称为分子烙印聚合物(MIPs)的新型SPE材料，由于其特有的高选择性^[1]，在分离科学中越来越得到广泛的关注。MIPs对于烙印的被测物能产生类似于抗体的亲合力，因此，与抗体类似，可用于高选择性的SPE中。分子烙印聚合物(MIPs)的起源可追溯到Pauling在试管内生产抗体的论文^[2]及Fischer的关于锁与钥匙的作用原理^[3]，并于1972年由Wulff等第一次所描述^[4]。分子烙印的一般原理如图1所示。

　　分子烙印的形成包括下面3个步骤：1)在非极性和非质子溶剂中，根据在给定的被测物(模板，烙印)与有功能团可聚合的单体之间存在的(非)?共价键合作用，形成了专一性的复合物。在这个步骤中，通过功能单体在被测物周围的组配预先构成键合位点。2)在有交联剂和聚合引发剂存在的条件下，在刚性和多孔共聚物内生成单淋?模板复合物，完成原位聚合。3)萃取除去模板分子，在聚合物骨架网格内留下独特的空腔。被烙印键合位点的局部化学属性与待测物的分子大小、形状及官能团是互补的，从而允许待测物分子专一性地与模板结合。

　　基于MIP萃取指定的目标被测物，采用非质子、低极性有机溶剂，特别是在聚合过程中使用的相应溶剂，可以得到最佳键合(分子识别)效果。在有机溶剂中，特定的氢键得到稳定，而非特异性的憎水作用将受到抑制。此外，MIP吸附剂与含有水溶性蛋白质的流体接触，可能会导致不可逆键合或基体组分的沉淀。因此，在纯水溶液中不能得到有效的分子识别，要成功地应用MIPs进行直接的、重复性的生物样品萃取净化是不可能的。

2 6-S流程(Six-SPE)

　　任意一种被侧物差不多都有独特性，因此作者在有效地利用MIPs的基础上，分别对水溶液的和生物流体的高选择性SPE建立了一个新的样品处理策略，被称之为“6-S流程”[Six-S ProcEdure(Size Selective Sample Separation and Solvent Swltch，SiX-SPE)]^[5]，可实现全自动(在线)联柱SPE流程(按分子大小进行选择性样品分离及溶剂切换)。6-S流程包含两个完全不同的步骤：第一步，采用特制的SPE吸附剂，对生物流体的大分子基体馏分和低分子质量组分按分子大小进行选择性分级；第二步，通过切换系统，采用高选择性的MIP吸附剂进行分子识别，分离待测组分。

　　采用填充体积排阻固定相(RAM)^[6]的小型HPLC柱(25 x 4mm i．d．)完成按分子大小的选择性样品分级。体积排阻填料为特殊的球状多孔硅胶颗粒(见图2)，其表面具有可分别与蛋白质和待测物作用的双模式局部化学特性。

　　颗粒的外表面由亲水性、电中性的双硅醇基所覆盖，外表面不吸附基体组分(如蛋白质)，而颗粒内孔表面由烷基链(如C18)所覆盖，被测物很容易到达疏水性的内孔表面，在此被萃取和富集。对比之下，大分子样品化合物因自身体积的阻碍作用(6 nm孔径)，它是按其分子大小选择的，并直接定量地排放到废液中。因此，应用RAM吸附剂可以多次注入未经处理的复杂生物样品(体液，血浆，血清，奶液，唾液，发酵肉汤，细胞培养液的上层清液，组织以及食品匀浆等)而不会影响到色谱分离效果。

　　采用纯有机流动相(乙脂优先)冲洗RAM柱，通过切换阀将RAM萃取物直接转移到相应的MIP吸附剂上。把被测物选择性地键合到烙印过的聚合物上，分子识别不会受到蛋白质、核酸等大分子基体组分的干扰，也不会受到水溶液条件的限制。Six-SPE操作程序扼要示于图3。

　　作为描述RAM。MIP组合的实例，作者通过柱切换设计在线分离模式，建立了一套全自动化的集成HPLC柱切换系统，并用于未经处理的人血浆中止痛药Tramadol(Grunenthal GmbH，Stolberg，Germany)的分离分析。用LiChrospher^®ADS RP-18(Merck KGaA，Darmstadt，Germany)作为RAM固定相进行分级，采用Tramadol?烙印的聚合物作为MIP吸附剂。Tramadol。烙印的聚合物由Johannes-Gutenberg大学(Mainz，Germany)的Sellergren和Lanza博士通过将甲基丙烯酸(功能单体)、乙二醇二异丁烯酸(交联剂)、甲苯(致孔剂)、偶氮二异丁腈(引发剂)混合，在15℃的汞灯下照射24h而合成。此后，将块状聚合物碾碎，并将颗粒彻底清洗和筛分。得到的可用填料直径为25?36Ltm，用MeOH／H20(50／50，vol／vol)调成匀浆后，把它填充到不锈钢HPLC柱管内(25×4mm i．d．)。

　　全自动SiX-SPE-LC分析100 μL未经处理的人血浆中的Tramadol得到的色谱分离结果见图4。用UV220nm检测，记录的色谱峰相当于lμg Tramadol直接进样的结果。

　　在最佳UV吸收波长下进行检测，通过比较采用两种处理方法得到的色谱图说明RAM与MIPs结合(即Six-SPE样品处理体系)能有效地从复杂试样中除去大分子(如蛋白)以及低分子质量的内源性基体组分。因而，定量测定试样中被测物不受干扰物的影响，使分析方法的准确性和灵敏度得到改善。

3 结论

　　本文提出了一种采用两种特殊填料(RAM-MIP)组合的生物样品预处理策略(Six-SPE)，它具有以下特征： 1)高选择性萃取和富集被测物；2)高效除去干扰的基体组分；3)重复性好，可直接进样，并能在线净化未经事先处理的生物流体；4)即时处理光敏性试样；5)提高分析方法的精密度、准确度及灵敏度；6)易于实现全自动化；7)在线联接其他分析系统(如HPLC)和／或适宜的检测器(如UV，FD，MS)。

参考文献:

1. Sellergren B. Noncovalent molecular imprinting: antibody-like molecular recognition in polymeric network materials.TrAC 1997; 16(6):310-20.
   
2. Pauling L. J Am Chem Soc 1940; 62:2643-57.
   
3. Fischer E. Chem Berichte 1894; 27(2):985.
   
4. Wulff G, Sarhan A. Use ofpolymers with enzyme analogues sRllctures for the resolution of enantiomers. Angew Chemie Int Ed Eng 1972; Il:341-4.
   
5. Fleischer CT, Boos KS. Analyte-specific on-line solid phase extraction. Gff Spezial Separation 2000; 20: 15-17.
   　　　　
6. Boos KS, Grimm CH. High-performance liquid chromatography integrated solid-phase extraction in bioanalysis using restricted access precolumn packings.TrAC 1999; 18(3):175-80.