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科研集市-1 利用CoIP-MS高效筛选体内互作蛋白
2018-07-30 14:42:08
众所周知，Co-IP是经典的利用抗体从样品中捕获靶蛋白及其互作蛋白、复合体的一项技术，能够特异性富集所研究的目的蛋白。由于过程中采用了非变性条件，保留了互作及复合体的细胞内状态。相对于酵母双杂交、pull down等方法，其特色之一便是捕获的蛋白互作发生在所研究的特定组织细胞内，保存了互作蛋白及复合体的“内源”状态。本文重在介绍Co-IP同蛋白质谱技术联用，进行高效筛选鉴定未知互作蛋白。经典Co-IP流程在收集捕获产物之后，通过SDS-PAGE、银染分析差异条带、Western Blot来鉴定某些预设的互作蛋白。这种途径限于通量、抗体等因素，适合点对点验证。CoIP-MS即为将免疫共沉淀和蛋白质谱技术串联，运用LC-MS/MS技术对Co-IP所捕获的蛋白产物进行鉴定分析的技术。相比于MALDI-TOF， LC-MS/MS方法具有更高的灵敏度和几乎100%的可靠性，是主流文献中最常用的方法。在对样本进行非变性条件的蛋白提取之后，Co-IP所获产物进行SDS-PAGE分离不同大小的蛋白，蛋白质还原烷基化及酶解，除盐之后的酶解产物进行LC-MS/MS鉴定，将下机数据进行数据库检索，获取产物中蛋白信息。之后再进一步进行对照组及样品组的韦恩分析，鉴定蛋白质的GO、COG和KEGG注释分析，以预测蛋白质的功能，揭示蛋白质在各个生命活动中的生物学意义。
（引自Keller-Pinter A, Ughy B, Domoki M,et al. The phosphomimetic mutation of syndecan-4 binds and inhibits Tiam1 modulating Rac1 activity in PDZ interaction-dependent manner. PLoS One. 2017 Nov 9;12(11):e0187094.）1. 样品蛋白提取为了保持目的蛋白本身及其互作蛋白、复合体的天然状态，不遗漏互作蛋白信息，Co-IP样品的蛋白提取应注意：不使用SDS、Sodium deoxycholate等离子型去垢剂，不能使用尿素、硫脲等强变性剂，也不能经过丙酮/TCA沉淀等导致蛋白变性的有机试剂处理。只能使用如NP-40、Triton X-100等非离子型去垢剂。此外，包括冻融、超声处理等条件也会不同程度破坏蛋白复合物的存在状态。因此，如何既保护蛋白活性又获取较高的提取效率，需要借助经验及预实验来确定实验条件。2. 免疫共沉淀Co-IP在Co-IP过程中，除了所用抗体性能达到IP级别的亲和力是先决条件之外，孵育体系中的总蛋白浓度、抗体用量、漂洗条件等方面也决定Co-IP过程的灵敏度以及特异性。通常总蛋白浓度需要≥1mg/ml，当总蛋白浓度足够高时，可以适当倍数稀释样品以降低其中去垢剂浓度，为抗体反应提供温和环境。使用protein A/G的磁珠或凝胶时不宜贪多，目前商品化产品其载量都在50ul用量时承载50ug或更多抗体，而通常一个Co-IP反应的用量在1-3ug左右。漂洗缓冲液需要控制适当的盐离子强度、去垢剂种类及浓度，通常会延用裂解液缓冲液配方，因为背景蛋白在后续质谱过程中会干扰蛋白的鉴定，优化漂洗缓冲液的目的是既保持目的蛋白复合物的捕获效率又尽量减少非特异结合蛋白。3. 质谱上机前样本处理蛋白质还原烷基化和酶解。蛋白质的还原烷基化如下，加入二硫苏糖醇(DTT)还原蛋白质，再加入碘乙酸铵(IAM)，最后加入Trypsin酶，过夜酶解，酶解后处理。酶解产生的多肽用C18柱子除盐，已经除盐的多肽抽干后用Loading Buffer 溶解多肽。多肽上LC-MS/MS仪器进行分析，然后对结果进行评估。
（引自Chen R, Xiao M, Gao H, et al. Identification of a novel mitochondrial interacting protein of C1QBP using subcellular fractionation coupled with CoIP-MS.[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2016, 408(6):1557-1564.）4. 数据检索、蛋白鉴定LC-MS/MS下机后，将原始下载数据直接提交到与质谱仪连接的Proteinpilot软件中进行数据库检索，过滤掉常见污染蛋白及与之匹配的肽段，得到每个样品鉴定到的肽段和蛋白结果。通常CoIP-MS是将IgG组及IP同时进行质谱鉴定，得到的反应两组蛋白差异的韦恩图。5. 鉴定蛋白功能注释对鉴定到的蛋白质进行GO、COG和KEGG注释分析，以预测蛋白质的功能，揭示蛋白质在各个生命活动中的生物学意义。其中，GO分析总共有三个本体（ontology），分别描述基因的分子功能（molecular function）、细胞组分（cellular component）、参与的生物过程（biological process）；COG是对蛋白质进行直系同源分类的数据库；KEGG是有关Pathway的主要公共数据库，通过Pathway分析能确定蛋白质参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。 -
番茄转录因子SlHZ24通过对D-甘露糖/L半乳糖通路的正调节 促进抗坏血酸积累
2018-04-28 09:35:52
文献来源：The tomato HD-Zip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.The Plant Journal（IF5.901）关键技术：酵母单/双杂交、双萤光素酶报告基因检测、EMSA番茄转录因子SlHZ24通过对D-甘露糖/L半乳糖通路的正调节促进抗坏血酸积累
研究背景抗坏血酸（AsA）一种抗氧化剂，可以清除植物在胁迫条件下产生的活性氧。本文通过酵母单杂交技术、瞬时表达和EMSA实验验证了SlHZ24和SIGMP3启动子结合，且SlHZ24表达水平与AsA积累呈正相关特性。相反，通过RNAi技术导致AsA表达量降低。SlHZ24同时也影响D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表达，如SIGME2、SIGGP和SIGMP4，说明抗坏血酸合成为多靶点调控。SlHZ24过表达植株对氧化应激的敏感性降低，作者推断SlHZ24促进抗坏血酸的合成，提高了植株对氧化应激的耐受性。研究内容1.SlHZ24属于HD-Zip I蛋白家族本文以维生素C合成的D-mannose/L-galactose途径中关键GMP基因为切入点。GDP-D甘露糖焦磷酸化酶（GMP）在D-甘露糖/L半乳糖通路中扮演了重要的角色，据报道GMP家族中只有过表达SIGMP3提高了抗坏血酸的表达且改善了氧化应激耐受性。因此，本文使用酵母单杂交找寻与SIGMP3启动子作用调节抗坏血酸的转录因子，共找到25个潜在蛋白，确认SlHZ24 为研究对象。序列分析显示SlHZ24含有HD和LZ结构域（图1a），且与其他HD-Zip I蛋白高度同源（图1b）。进化分析的结果也说明SlHZ24与拟南芥的HD-Zip I蛋白同源。因此，SlHZ24属于HD-Zip I蛋白。
2.酵母单/双杂交验证SlHZ24反式激活作用酵母双杂交验证了SlHZ24反式激活，含pBD-SlHZ24的实验组可在SD/–Trp–His–Ade平板上生长，而对照组不生长（图2a）。酵母单杂交验证了不同长度SlHZ24和SIGMP3启动子的作用，其中SlHZ24全长、N3、N4、N5、N6、N7包含HD结构域表现为正常生长，N1不包含HD结构域表现为细胞不生长，N2包含不完整的HD结构域表现为生长缓慢，说明HD结构域为互做结构域（图2a）。
3. 瞬转及双萤光素酶检测验证SlHZ24与SlGMP3启动子结合将SlGMP3启动子分成4段进行双萤光素酶检测实验（图3a、3b），P1和P2启动子区域检测到荧光增强，实验结果说明SlHZ24结合SlGMP3启动子的第二段序列，即-2411到-2313bp为结合区段。
4．进一步验证SlHZ24和SlGMP3结合酵母单杂交验证不同的SlGMP3启动子和SlHZ24的结合情况（图4a），结果显示SlHZ24蛋白与SlGMP3启动子的结合位点为-2411到-2313bp，突变实验（图4b）、EMSA实验（图4c）也证实了这点。这些结果表明SlHZ24直接与SlGMP3的上游元件结合来启动下游表达。
5. 不同番茄组织及转基因番茄中SlGMP3和SlHZ24检测使用qPCR对番茄不同组织中的SlGMP3启动子和SlHZ24的表达量进行了检测，发现两者都在茎和叶总的表达量较高（图5a），说明SlHZ24正向调节SlGMP3表达。为了验证SlHZ24对SlGMP3的影响，分别建立的SlHZ24过表达和干扰转基因番茄进行下一步实验（图5b）。
6. SlHZ24通过调节SlGMP3表达来改变AsA的合成对过表达、干扰番茄叶及果实中AsA的检测（图6a 、6b）实验，说明SlHZ24在番茄叶和果实中同时调节抗坏血酸的合成。过表达SlHZ24的OX-13植株果实中SlGMP3基因的表达量明显高于野生型，而干扰SlHZ24的KD-9植株果实中SlGMP3基因的表达量变化不大（图6d）。有趣的是在干扰SlHZ24的植株叶子中SlGMP3基因的表达量显著减少，而过表达SlHZ24的植株叶子中SlGMP3基因的表达量变化不大（图6c）。对转基因番茄中其他GMP家族基因的检测结果说明SlHZ24可能调节多种SIGMP基因（图6c、图6d）。
7. 番茄中AsA和SlGMP3检测为了检测番茄果实成熟过程中SlHZ24如何影响SlGMP3，对不同时期果实的AsA和SlGMP3表达量进行了检测（图7a、7b），结果表明SlHZ24在番茄成熟的过程中可以调节SlGMP3的表达，其中以破色期果实调控效应最为显著，除了红果实成熟期。
8. SlHZ24转基因番茄中D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表达检测使用qPCR对番茄的叶和果实进行了检测（图8a、8b），结果表明在野生型和转基因番茄中SIGME2、SIGGP基因表达量发生了改变，显示SlHZ24的多点协同调控作用。
9. SIGME2、SIGGP启动子实验使用EMSA实验验证转录因子SlHZ24和启动子SIGME2、SIGGP有互做关系。
10. SlHZ24光响应及氧化应激的作用为了研究光对AsA的作用，作者对不同光处理番茄中的AsA和SIHZ24的表达量进行了检测（图10a、10b），结果表明SIHZ24可以被光激活且AsA的表达也随之提高。使用MV对转基因番茄进行处理，同时对叶绿素和MDA浓度进行检测，说明SIHZ24过表达可以提高植物对氧化应激的耐受性。
文章小结目前植物合成AsA基础途径已经明确，但对AsA合成代谢的调控机制知之甚少。本文研究了番茄转录因子SlHZ24结合SIGMP3启动子从而增加AsA表达水平的机制，进而提高植物对氧化应激的耐受性。AsA（又称维C），是生物体一类小分子抗氧化剂物质，能清除体内活性氧，增强有机体抗氧化能力，保证新陈代谢正常进行。不过人类自身不能合成维C，必须从食物中摄取。本研究首次发现调控果实AsA积累的转录因子，对揭示AsA调控机制和未来品质改良具有重要意义。备注：本文出于传递更多信息为目的解读该文献内容，不希望转载个人可与我联系，会立即删除处理。 -
蛋白质-核酸相互作用研究方法介绍
2017-11-23 16:35:13
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- 更新时间: 2019-06-27
