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lncRNAH19作为ceRNA通过调控RNAmiR-29b-3p来调节膀胱癌细胞上皮间质转化和转移
2017-12-28 11:44:48
文献：lncRNA H19 regulates epithelial–mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer by miR-29b-3p as competing endogenous RNA. Biochim Biophys Acta（IF6.261）关键技术：1、病毒转染（慢病毒包装、腺病毒包装）2、分子互作技术（Pull down、RIP（MS2/Ago）、双荧光素酶实验）3、检测分析（免疫组化、克隆形成、细胞划痕愈合、CCK8、EdU、HE染色、WB、ELISA、q-PCR）4、分子定位技术（FISH、IHC、免疫荧光、激光共聚焦）5、芯片技术（lncRNA/mRNA芯片）长链非编码RNAH19作为内源竞争性RNA通过调控RNAmiR-29b-3p来调节膀胱癌细胞上皮间质转化和转移
研究背景EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)主要在肿瘤侵袭和转移中发挥作用，其改变主要表现在分子、细胞、组织水平，涉及组织细胞形态改变、组织特异分子表达的改变。通过检测相关分子表达水平或细胞形态改变可以评估肿瘤进展、了解药物疗效及基因功能作用。lncRNA（long noncoding RNAs）与肿瘤的发生发展关系密切，越来越多的研究表明，lncRNA可以调控肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡、分化进而调控肿瘤的发生发展。本文以膀胱癌和肿瘤侵袭为研究对象，聚焦EMT过程和lncRNA功能机制，以lncRNA调控EMT机制为主线，综合运用芯片、生物信息学分析、分子互作技术（RIP、RNA pulldown、双荧光素酶）、分子定位（免疫荧光、FISH）等技术研究了lncRNA的下游互作分子，探讨了H19（lncRNA）功能机制。构建了H19调控膀胱癌侵袭、转移的作用轴线（如下图）。
研究内容及结果1、临床研究水平，研究了正常人和病人H19和DNMT3B的表达水平和相关性。2、体外实验，寻找并综合运用多种技术手段验证了H19的相互作用靶分子miR-29b-3p及miR-29b-3p的相互作用靶分子DNMT3B3、体内实验，运用裸鼠成瘤实验验证了H19对肿瘤侵袭转移的作用。一、临床研究水平研究了癌组织和癌旁组织以及膀胱癌细胞系中H19和DNMT3B的表达水平和相关性。发现H19和DNMT3B在癌组织中高表达而在癌旁组织中低表达。运用pearson correlation分析发现H19和DNMT3B的高表达具有正相关性。这暗示了H19对DNMT3B可能具有正调控关系。这是后面作者进行生物信息学预测和机制功能研究的基础。1、作者首先统计了临床上H19的表达和膀胱癌患者性别、年龄、肿瘤病理分期、淋巴转移的关系。发现高表达的H19和膀胱癌的分期和淋巴转移存在密切关系（P<0.05）。
2、运用芯片和q-PCR研究了H19和DNMT3B在膀胱癌和癌旁组织中的表达水平。芯片技术发现H19和DNMT3B在肿瘤组织中均高表达，而在癌旁组织中低表达，芯片的结果得到了q-PCR的验证。
3、Pearson correlation分析发现H19和DNMT3B的高表达具有正相关性，说明H19对DNMT3B的表达可能具有正调控作用，如果H19作为ceRNA，则可能存在miRNA来受lncRNA的调节来调控DNMT3B。
4、在组织水平之外，作者也研究了常用的几种膀胱癌细胞系中的H19表达水平，发现在常用的几种癌细胞系中H19均高表达。
二、体外实验临床实验证实了H19与膀胱癌的分期、转移有密切的关系，同时H19和DNMT3B可能存在正调控关系。作者综合运用多种功能实验研究了H19的体外功能，在此基础上然后运用生物信息学分析方法和多种互作技术预测并且验证了H19的互作分子miR-29b-3p和下游调控靶分子DNMT3B。1、功能研究。作者综合运用CCK8、EdU、克隆形成、划痕愈合、Transwell、免疫荧光等技术对H19的生物学功能进行了研究，发现H19可以促进癌细胞的增殖、侵袭、迁移、转移和细胞骨架重构。
2、机制研究。生物学预测发现H19和DNMT3B都可以与miR-29b-3p结合。双荧光素酶证实H19、DNMT3B可以与miR-29b-3p直接结合。FISH实验可以发现H19和miR-29b-3p在细胞内存在共定位。GFP-MS2-RIP和RNA-pulldown实验验证了H19可以内源性结合miR-29b-3p。Anti-AGO2 RIP进一步验证了H19可以通过AGO2与miR-29b-3p结合。而H19、DNMT3B和miR-29b-3p的三因子双荧光素酶实验最终确认三者的ceRNA调控网络。
三、体内实验在几个膀胱癌细胞系的体外机制研究表明，H19与miR-29b、miR-29b与DNMT3B之间存在调控关系，H19作为ceRNA可以通过直接调控miR-29b来调控DNMT3B的表达，进而调控下游相关分子的表达和EMT相关功能的实现。接着作者用裸鼠成瘤实验验证了H19、miR-29b对膀胱癌细胞成瘤能力、转移能力、血管形成的影响。
文章总结作者从临床案例入手发现了膀胱癌与H19表达关系，然后运用芯片技术和q-PCR进一步验证了膀胱癌中H19和DNMT3B存在正相关关系，生物信息学分析预测了由miR-29b调控DNMT3B表达的ceRNA网络关系。体外实验中，互作分子技术（双荧光素酶实验、RIP、RNA pulldown）验证了生物信息学的预测，功能实验验证了H19、miR-29b和DNMT3B三种在细胞增殖、侵袭、迁移、EMT转化中的作用和相互作用关系。接着作者进一步开展了体内实验，裸鼠成瘤实验证实了H19可以促进膀胱癌细胞的增殖、淋巴转移、血管生成。这样作者从临床、体外、体内三个水平探究了作为ceRNA的lncRNA（H19）在调控膀胱癌细胞侵袭转移EMT转化中的调控网络，描绘了H19/miR-29b/DNMT3B调控主线。本文采取病毒包装、分子互作（Pull down、RIP、双荧光素酶实验）、检测分析（免疫组化、WB、q-PCR）、分子定位（FISH、IHC、IF）、lncRNA/mRNA芯片等方法，研究lncRNAH19通过调控miR-29b-3p调节膀胱癌细胞上皮间质转化和转移机制。文献全文索取、技术服务沟通可随时@qq3268908524......
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假单胞菌转录调节因子AlgR通过非编码RNA RsmZ调控脂肪酶LipA表达探讨
2017-12-25 14:34:47
参考文献：The Pseudomonas transcriptional regulator AlgR controls LipA expression via the noncoding RNA RsmZ in Pseudomonas protegens Pf-5. Biochemical and Biophysical Research Communications（IF2.466）关键技术：EMSA、基因敲除CRISPR-Cas9、lacZ报告基因假单胞菌转录调节因子AlgR通过非编码RNA RsmZ调控脂肪酶LipA表达机制探讨
脂肪酶（Lipase）是一种存在于动物、植物、微生物中的工业用酶，广泛应用于食品、去垢剂、生物质能等领域。目前商品化的脂肪酶主要来源于微生物，但传统的育种、培养基营养优化的手段在提高其产量方面面临瓶颈，亟待从分子机制层面寻找解决途径。目前研究证实细菌中脂肪酶的表达受到双组份调控体系如LipQ-LipR调节，但假单胞菌P. protegens Pf-5菌株的分子调控机制有待深入研究，AlgR作为转录调控因子在假单胞菌P. protegens Pf-5菌株中对于脂肪酶产量控制关系及机理此前还未见报道，同时已知AlgR也能够调节ncRNA RsmZ，故而本文采取基因敲除、lacZ报告基因、EMSA等方法研究AlgR对于lipA的表达调控机制。研究内容及结果1. 证实AlgR在转录水平控制lipA表达构建了algR敲除的Pf-5菌株（名为Pf6003），培养测定其生长曲线，并检测对比敲除菌株中lipA酶活性。结果显示野生型、algR敲除型Pf-5菌株的呈现一致生长曲线，说明algR的敲除不影响Pf-5的生长（图A），但是敲除株的总脂肪酶活性显著下降（图B）。
此外将lipA的启动子连接lacZ报告基因、将报告基因质粒分别转入野生型及突变型Pf-5菌株，后续检测β半乳糖苷酶（b-galactosidase）活性，发现在敲除突变株中b半乳糖苷酶活性低于野生型（图C）。通过RT-PCR检测lipA的mRNA表达，显示突变株中lipA mRNA水平降低（图D）。
同时通过lacZ报告基因实验显示algR的补偿过表达在野生型和缺失突变型Pf-5中都能提高β半乳糖苷酶活性及lipA酶活性。
2. AlgR影响rsmX/rsmY/rsmZ的表达使用RT-PCR实验证实在Pf-5菌株中敲除AlgR基因后，rsmX/rsmY/rsmZ的转录水平均上调。
3. AlgR直接结合于rsmZ启动子序列本文表达纯化了AlgR蛋白、合成了rsmX/rsmY/rsmZ启动子序列的探针，进行EMSA实验验证AlgR蛋白同这些基因启动子序列的互作关系，证实AlgR蛋白存在直接相互作用、而AlgR蛋白不能结合于rsmX/rsmY的启动子序列。
5. AlgR通过rsmZ调节lipA的表达构建了rsmZ敲除的Pf-5菌株（名为Pf6285），并构建了同时双敲除algR和rsmZ的Pf-5菌株（名为Pf6100），通过lazZ报告基因及酶活力测定显示，同时敲除algR和rsmZ基因的Pf6100中lipA表达及总酶活性显著低于algR单独敲除的菌株，而在algR单独敲除株中过表达rsmZ能够使lipA酶表达及活性恢复到野生型水平。
总结构建了分别单独敲除algR或rsmZ的假单胞菌株Pf-5，及同时敲除algR和rsmZ的菌株，通过lacZ报告基因系统以及细胞总酶活力测定，证实了algR的缺失突变导致lipA水平下降，同时rsmZ的过表达能够补偿algR缺失对于lipA的下调效应，并通过EMSA实验验证了AlgR蛋白能直接结合于rsmZ的启动子序列，说明algR基因是通过rsmZ来调控假单胞菌株Pf-5中lipA的表达水平。 -
miR-124a通过沉默FOXA2导致细胞内脂质积聚异常的机制探讨
2017-12-25 13:46:00
参考文献:Mesenchyma stem cells as natural bio-factories for exosomes carrying miR-124a in the treatment of gliomas. Neuro-Oncology（IF7.786）关键技术：1. 重组病毒包装：慢病毒包装、稳转株；2. 分子生物学：Cre-loxP位点特异性重组酶系统；3. 检测分析：WST-1、Transwell、qRT-PCR、Western blot、纳米颗粒跟踪分析技术；4. 动物实验：裸鼠颅内移植瘤模型miR-124a通过沉默FOXA2导致细胞内脂质积聚异常从而引起细胞凋亡
胶质母细胞瘤是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤，已有研究表明microRNAs（miRs）有希望成为胶质母细胞瘤的新型治疗方法。然而，何种miRs对抗胶质母细胞瘤的效果最佳，以及如何将miRs递送至胶质母细胞瘤是目前尚未解决的问题。本文通过功能筛选，作者发现miR-124a抗胶质瘤的效果最为显著，使用含有miR-124a的慢病毒载体感染间充质干细胞（MSCs），并用分离获得的外泌体处理胶质瘤干细胞（GSCs）后发现GSCs活力显著下降，体内实验证实Exo-miR124能使颅内移植GSCs的小鼠存活更久。研究表明miR-124a通过沉默FOXA2导致细胞内脂质积聚异常从而引起细胞凋亡。因此，MSCs可以作为一个产生exo-miR124的天然生物工厂来参与抗胶质瘤治疗。研究内容及结果1. miR-124a是一种能有效抗胶质瘤的microRNA基于数据查询，作者选取8个研究报道具有抗胶质瘤特性的miRs进行初步筛选。采用慢病毒载体将这些miRs分别转移至5种不同的GSCs，通过WST-1测定发现在所有GSCs细胞系中miR-124a引起细胞增殖能力降低的效果最显著，表明miR-124是最为有效的抗胶质瘤microRNA。
2.MSCs能够有效地将miR-124a转移至GSCs作者使用慢病毒包装miR-124a并感染MSCs，通过Transwell与WST-1以及台盼蓝染色结合证实MSCs-miR124导致GSCs的增值能力显著下降，暗示MSCs可通过某种方式将miR-124a转移至GSCs。
3. MSCs将miR-124a包装至外泌体并进一步转移至GSCs作者通过透射电镜观察、纳米颗粒跟踪分析技术结合对外泌体标记蛋白的Western blot检测证实MSCs释放的颗粒是外泌体，且外泌体中miR-124a的含量显著上调。进一步通过Cre-loxP位点特异性重组酶系统结合qRT-PCR和Western blot检测证实外泌体能够将功能性的RNA分子转移至肿瘤细胞。
4. 携带miR-124a的外泌体在小鼠体内能够有效对抗胶质瘤研究表明，在裸鼠额叶内移植GSC267细胞一周后，分别通过腹腔注射和静脉注射携带miR124的外泌体（Exo-miR124）能够使裸鼠存活时间更长。组织切片结果表明，裸鼠脑部的肿瘤完全消退，证实Exo-miR124在小鼠体内同样能够有效对抗胶质瘤。
5. Exo-miR124抑制FOXA2的表达并改变GSCs的脂质代谢作者通过体内和体外实验检测已知的miR124-a靶基因蛋白表达水平，发现仅FOXA2的表达量显著下调。慢病毒介导的不同水平的FOXA2干扰表达同样引起GSCs的增殖能力，从而产生对应剂量效应的下降。互补实验以及进一步的油红O染色和Western blot检测结果表明，miR-124a通过下调FOXA2的表达引起细胞内脂质积累，最终导致肿瘤细胞凋亡。
总结首先通过筛选确定了miR-124a是最有效的抗胶质瘤microRNA，以慢病毒为载体将miR-124a转移至MSCs后发现其分泌的外泌体中同样携带miR-124a，体内体外实验均表明Exo-miR124能够抑制GSCs的增殖。进一步的机理研究发现miR-124a通过下调FOXA2的表达从而引起细胞内脂质积累，导致脂质代谢异常并最终引起肿瘤细胞凋亡。本文首次提出MSCs可以用于离体生产携带抗胶质瘤microRNA的外泌体，以期实现消除恶性神经胶质瘤。以上是miR-124a通过沉默FOXA2导致细胞内脂质积聚异常从而引起细胞凋亡的探讨内容及结果，供学习参考！@3268908524索取文献全文，咨询服务外包均可。miRNA靶基因筛选及验证 非编码RNA研究.外泌体研究.表观遗传调控...... -
[论坛]lncRNA研究之RNA pull-down问答集锦
2017-11-12 16:55:08
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探讨lncRNA--ZFAS1的扩增促进肝癌转移的机制
2017-11-12 16:09:31
参考文献：Zhecheng Z, Li T, Xie J, et al. Amplification of long non-coding RNA ZFAS1 promotesmetastasis in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer research, 2015: canres. 3721.2014.
基本点：MS2蛋白是MS2噬菌体的包膜蛋白，可以与噬菌体复制酶的5′端由19个碱基组成的茎环序列特异地结合。LncRNA--ZFAS1的扩增促进了肝癌细胞的转移机制探讨利用GEO数据库及两种lncRNA芯片数据，筛选得到肝癌组织中58个lncRNA个上调的和3个lncRNA下调，通过建立共表达网络，确定了5个重要的lncRNA，其中上调最为明显的是ZFAS1。因此后续的研究重点是ZFAS1在肝癌细胞中的表达模式、临床意义、生物学功能。文献中经典研究思路：（原谅我读的文献少，只是先解读了主要的研究思路。）
研究者对ZFAS1促进肝癌细胞转移的原因进行了探索。生物信息学分析表明，ZFAS1序列上有一个miR-150的结合位点，为了验证这个结合位点，研究者构建了一个融合MS2茎环结构（即MS2结合蛋白互作位点MS2bs）的特殊ZFAS1重组转录本，该转录本能与MS2bp和GFP形成一个复合体，利用GFP抗体进行RIP实验,对富集的miR-150进行qPCR验证。结果表明，携带有WT型miR-150结合位点的ZFAS1重组转录本可以明显富集miR-150，但mut型则无法富集miR-150。
研究者们利用生物素标记的特异ZFAS1探针进行的RNA pull down也进一步证实了ZFAS1与miR-150的特异性结合。
同时，也采用生物素标记的miR-150进行反向pull down，检测miR-150是否能拉下ZFAS1，结果表明只有WT型miR-150可以富集ZFAS1，mut型则无法富集ZFAS1，综合表明ZFAS1确实会作为一个ceRNA结合miR-150。
另外，研究者们也进一步证实，miR-150通过抑制内源ZEB1、MMP14、MMP16（肿瘤代谢中重要的调控因子）的表达减少细胞侵袭，ZFAS1通过影响miR-150对ZEB1、MMP14和MMP16三个基因的调控，造成三个基因表达上调，ZFAS1的沉默及过表达实验也证明了ZFAS1通过竞争性结合miR-150，正调控ZEB1、MMP14、MMP16这三个基因的表达。（相关实验设计和结果数据，能力、时间有限，后续再行补充更新该文章。）本项研究发现了肝癌细胞侵袭及转移相关的一个重要lncRNA—ZFAS1，通过对ZFAS1在肝癌细胞中调控机制的进一步探索，结果表明ZFAS1通过影响miR-150调控肿瘤侵袭及转移，ZFAS1的过表达促进了肝癌细胞的侵袭和转移，为此，ZFAS1可能作为未来肝癌诊断及治疗靶点，便于开发新的治疗方法。（索取文献&已解读过的朋友也可@qq3268908524互相交流。我也是可以从网站上下载文献的哦！文献中采用的RIP、RNA pull down都属于蛋白与核酸互作验证常用技术方法，用于拉下RNA、蛋白质，而拉下蛋白的后续实验目的通常聚焦到蛋白功能验证上，常用手段之一--蛋白质组学，那么下期再会：iTRAQ经典技术分享）备注：本文章出于传递更多信息为目的解读了该文献部分内容，且已注明文献、作者，不希望转载的个人可与我联系，会立即删除处理。
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- 更新时间: 2019-06-27
