DC-CIK的制备方法（四）
4. DC 细胞的培养及鉴定
4.1 步骤 3.2 中剩下的贴壁细胞 （主要是 CD14+的单核细胞），加入含重组人 GM-CSF500-1,000U/ml 和重组人 IL-4 500U/ml 的无血清培养液，37℃，5%CO2 培养箱中 培养，诱导单核细胞向 DC 细胞分化。
4.2 每 3d 半量换液一次，并补足细胞因子；
4.3（可选步骤） 在培养的第 5d, 加入步骤 2 中获得的肿瘤抗原 50 mg/ml,对 DC 进 行抗原负载；注：若不对 DC 进行抗原负载，该步省略。
4.4 在培养的第 6d,加入重组人 TNF-α（500U/ml），诱导 DC 细胞成熟。
4.5在培养的第 7d 或第 8d,收获 DC 细胞，其数量应达到 1×106 个以上。
4.6DC 的质检：
4.6.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在 80% 以上；
4.6.2 流式细胞仪检测 DC 细胞表面 HLA-DR、CD83 和 CD86 等分子的表达，以 确定 DC 是否成熟。
5. DC-CIK 细胞的制备和质检
5.1 收集步骤 4 和步骤 3 中所获得的 DC 细胞和 CIK 细胞，按 1∶10 （数目比） 的比例共培养，无血清培养液中添加重组人 IL-2 （300 U/ml）。
5.2每 3 天半量换液一次，并补加重组人 IL-2 （300U/ml）。
5.3 在第 7d 收集细胞，细胞数量应达到 1×1010 个以上。
5.4 DC-CIK 细胞的质检：
5.4.1 台盼蓝染色检测：活细胞应在 80% 以上；
5.4.2 流式细胞仪检测细胞表面 CD3、CD8、CD56 等分子的表达：CD3+CD56+细 胞的比例应在 20% 以上。
5.4.3 细胞杀伤实验：以 DC-CIK 细胞为效应细胞，以肿瘤细胞 （可为原代肿瘤细 胞或肿瘤细胞株） 为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按 10 : 1（数目比） 的比例加 入 96 孔 U 型板中，每孔含靶细胞 1 x 104 个，终体积为 200 ml，设 3 个复 孔。培养 4 h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶 （LDH） 试剂盒检测效应细胞 对靶细胞的杀伤率。
5.4.4 收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体， 及内毒素 （标准：病原学检测阴性，内毒素<5 Eu）。
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技术原理
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