BAL31 核酸酶消化法产生双向缺失突变体实验
试剂、试剂盒 BAL31 缓冲液EGTA乙醇酚氯仿醋酸钠蔗糖凝胶上样缓冲液TE噬菌体 T4DNA 聚合酶BAL31 核酸酶大肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段限制性内切酶琼脂糖凝胶用于凝胶电泳的 DNA 分子量标准
仪器、耗材 计时钟水浴
实验步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录 1, 将贮存液稀释到合适的浓度。
5XBAL31 缓冲液
2.5mol/LNaCl
62.5 mmol/LCaCl2
62.5 mmol/LMgCl2
100 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
有 4 种 dNTP 的溶液，每种浓度为 0.5 mmol/L
EGTA(0.5mol/L,pH8.0)
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
醋酸钠（3mol/L，pH5.2)
蔗糖凝胶上样缓冲液
TE(pH7.6)
酶和缓冲液
噬菌体 T4DNA 聚合酶
BAL31 核酸酶
大肠杆菌 DNA 聚合酶 IKlenow 片段
限制性内切酶
请见步骤 3、23 和 31。
凝胶
琼脂糖凝胶
请见步骤 3 和 32。
含 0.5ug/ml 溴化乙锭的琼脂糖凝胶（0.8%)
请见步骤 11。
用 TBE 配制的含 0.5ug/ml 溴化乙锭的琼脂糖凝胶
请见歩骤 25。
制备琼脂糖凝胶
请见步骤 27。
核酸和寡核苷酸
用于凝胶电泳的 DNA 分子量标准
专用设备
计时钟
65°C 水浴和适合限制性内切核酸酶消化溫度的水浴
其他试剂
本方案步骤 1 需要的试剂列在第 1 章方案 17~19 或第 3 章方案 6 中。
本方案步骤 2 需要的试剂列在第 1 章方案 9 中。
本方案步骤 27 需要的试剂列在第 5 章方案 4、5、6 或 7 中。
本方案步骤 30 需要的试剂列在第 1 聿方案 23~26 或第 3 章方案 6 或 8 中。
本方案步骤 31 需要的试剂列在第 1 章方案 1 或第 3 章方案 3 中。
本方案步骤 34 需要的试剂列在第 12 章方案 3、4、5 中。
方法
制备用于 BLA31 消化的靶 DNA
1. 将靶 DNA 片段克隆进合适的质粒或噬菌体 M13 载体。
如果拟从靶 DNA 的两个末端同时构建缺失突变体，需要选择有多克隆位点的适当载体将靶 DNA 从两个方向克隆进载体。
2. 用 Qiagen 层析柱（或相当的产品）和乙醇沉淀纯化闭合环状重钽 DNA。把 DNA 重新溶解在最小体积的 Tris/EDTA 溶液中。
使用高纯度的闭合环状 DNA 是很重要的，（i) 降低反应中污染的 RNA 和大肠杆菌染色体 DNA 小片段在总末端浓度中的比例；（ii）删除能够被 BAL31 降解的带缺口的环状 DNA。
3. 用切割位点位于靶 DNA—端的限制酶完全消化 30ug 闭合环状 DNA。界定该位点为嵌套缺失起始的共同点。琼脂糖凝胶电泳验证限制酶消化完全。
4. 等体积的酚: 氯仿抽提纯化 DNA。在微型离心机上以最大离心速度离心 3 min 分离有机相和水相，将水相转移到一个新的微量离心管中。
5. 加入 0.1 倍体积的 3mol/L 醋酸钠（PH5.2) 和 2 倍体积冰上预冷的乙醇。在 O°C 温度下放置 10 min, 在微型离心机上以最大转速 4°C 离心 10 min 收获 DNA。
6. 除去上清，用 70% 的乙醇室温下小心漂洗 DNA 沉淀物。室温下干燥 DNA 沉淀物，用 TE(pH7.6) 缓冲液溶解 DNA 沉淀物使之达到 lug/ul 的余度。在-20°C 条件下贮存 DNA。
BAL31 活性分析
大多数商业化的 BAL31 酶制品含有两种动力学上截然不同的酶活性形式：快形式和慢形式（请见信息栏关于 BAL31)。慢形式是快形式的蛋白水解降解产物。BAL31 消化 DNA 的速率是所用特定酶制剂中快形式与慢形式比例的函数。目前能够得到纯化的快速酶制剂（Weietal.1983), 但很昂贵，而且在贮存过程中经常衰变成慢形式。为了使 BAL31 保持在快形式状态，不应将酶冷冻而要贮存于 4°C。
由于 BAL31 中快、慢形式的比例因制剂而异，因此必须按以下步骤测定用于构建缺失体的特定批次的酶活性。
7. 在微量离心管中混合：
线状 DNA(1ug/ul) 4ul
水 48ul
5XBAL31 缓冲液 13ul
按的量将以上混合物分配到 7 个微量离心管中。
8. 用 1XBAL31 缓冲液把 BAL31 进行 7 次 2 倍稀释，最好按以下方法稀释，将 7 滴（2ul)1XBAL31 缓冲液点在置于冰床或冰冷的金属块上的石蜡膜表面上，用一次性微量移液器吸头吸取 2ul 待实验的 BAL31 酶与第一滴 BAL31 缓冲液混合。换一个新的吸头吸取 2ul 上述 BAL31 和缓冲液的混合物转移至第二滴 BAL31 缓冲液中，再度混合均匀。如此类推，直到所有的 BAL31 缓冲液均已与酶混合。迅速地从后 6 份混合液中分别取出 1 至 6 个含线状 DNA 的微量离心管中，第 7 个反应管中不要加酶。
大多数商业化 BAL31 酶制剂的浓度大约为 1 单位/ul;0.05~0.1 单位的 BAL31 酶足以将 1ug 长度为 2kb 的线状 DNA 分子消化成长度小于 200bp 的片段。
9. 将所有微量离心管（包括不加酶的管）在 30°C 孵育 30 min。
10. 每个反应管中加入 1ul200 mmol/LEGTA(pH8.0), 然后于 65°C 加热 5 min。
BAL31 反应需要 Ca2+, 酶活性可以被 EGTA 完全抑制。65°C 加热 5 min 也可以使该酶灭活。
11. 以上每份样品与 3ul 琼脂糖凝胶上样缓冲液混合，在含 0.5ug/ml 溴化乙锭 (0.8%) 的琼脂糖凝胶上电泳，分析 DNA 的大小。
12. 在紫外灯照射下检査凝胶，并决定合适的酶稀释度，即刚好使 DNA 得到适度的消化，以至只检测到弥散的小片段 DNA(200bp)。该稀释度将被用于大规模消化反应（步骤 15)。
另一种检査 BAL31 消化程度的方法是设 SBAL31 大量消化反应，在不同的时间点上取样。用限制性内切核酸酶消化毎一份样品，限制酶应能切割靶片段数次。随着 BAL31 消化过程的进展，限制酶片段以一定的次序消失。从限制酶片段的大小位置，便能估计出 BAL31 的消化速率。大量消化反应中使用的 BAL31 量应在反应开始后的前 5 min 内足以使靶片段的长度减少 20%。
用 BAL31 进行大量消化
13. 混合
线状 DNA(1ug/ul) 20ul
水 240ul
5XBAL31 缓冲液 65ul
30°C 水浴中孵育以上混合物。
14.30°C 孵育期间，准备 8 个微量离心管，每管中含有 5ul 200 mmol/LEGTA(pH8.0)，将离心管标记为 1.5 min、3 min、4.5 min 等时间段。
15. 将 36ul 稀释的 BAL31(请见步骤 12) 加入到步骤 13 反应混合物中，轻敲离心管壁，将内容物快速混合均匀后放回到 30°C 水浴中，开始计时。
16. 每隔 1.5 min 将 45ul 反应混合物转移到带相应标记的微量离心管中，将离心管置于冰上，直到所有样品收集完毕。
17.65°C 加热 5 min 灭活 BAL31 酶。
18. 每管中加入 5ul 3 ml/L 的醋酸钠（PH5.2), 再加入 100ul 冰冷的乙醇，振荡混合溶液，将离心管放置在冰上 20~30 min。
19. 最大转速 4°C 离心回收 DNA, 除去上清，用 200ul 冰冷的 70% 的乙醇洗涤沉淀物，再离心 2 min。
20. 仔细的去除上清，将敞开管盖的离心管直立放置在室温，直到所有的乙醇挥发殆尽。将每份沉淀物溶解在 23ulTE(pH7.6) 中。
分离截短的靶片段
21. 每份 DNA 制备物中加人：
0.5 mmol/LdNTP 溶液 3ul
10X 聚合酶缓冲液 3ul
噬菌体 T4DNA 聚合酶（约 5 单位） 1ul
室温下反应 15 min, 然后加入 1(约 5 单位）的 Klenow 片段。继续在室温下孵育 15 min。
在修复反应中使用两种不同的 DNA 聚合酶，可使突变体的回收率增加近三倍。
22. 用酚: 氯仿抽提纯化 DNA, 按步骤 18~20 所描述的过程用乙醇沉淀 DNA。将每份 DNA 溶解在 16ulTE(pH7.6) 中。
23. 在毎一份 DNA 中加入 2ul 相应的 10x 限制酶缓冲液和 8 单位的可使靶 DNA 和载体分开的限制酶，在适当的温度下孵育反应 1h。
24. 在孵育结束时，从每一个消化反应中取出 3ul 转移至一个新的微量离心管中，剩余的消化反应放置在冰上以备步骤 27 使用。
25. 每 3ul 上述反应液中加入 1ul 蔗糖凝胶上样缓冲液混合，将样品加到含有 0.5ug/ml 溴化乙锭和 0.5XTBE 的琼脂糖凝胶加样孔中。凝胶边上的加样孔内应加入一个适当大小的分子量标准参照物。
灌制的琼脂糖凝胶的浓度应适合分离靶片段和栽体（请见第 5 章导言部分的表 5-2)。
26. 利用凝胶电泳分离靶片段和载体 DNA, 在紫外光照射下观察凝胶，并决定哪份样品已被 BAL31 消化至合适的大小。
27. 合并含合适大小靶 DNA 的质粒样品，按第 5 章方案 4~7 描述的方法通过制备凝胶分离并回收靶 DNA 片段。
28. 根据溴化乙锭产生的荧光强度，估计出所纯化的靶 DNA 量。
克隆缺失的靶片段
29. 用质粒、噬菌粒或噬菌体 M13 载体（见第 1 或第 3 章）与缺失的粑片段连接。载体应携带一个钝端和一个与步骤 23 使用的内切酶相匹配的末端。
连接反应的确切成分和体积取决于靶 DNA 的量，如果可能，应使用 50ng 或 100ng 靶 DNA。保证载体 DNA 对靶 DNA 的摩尔比至少为 5(以便最大限度地减少含有一个以上靶 DNA 片段重组子的数量)。为了最大限度地形成重组体，连接反应应在适于钝端连接的条件下进行，例如在高浓度的噬菌体 T4DNA 连接酶、聚乙二醇和低浓度 ATP 的小反应体积中进行。有关连接条件的详细情况，请见第 1 章方案 19。
30. 用小量的或稀释的连接混合物转化（质粒或噬菌粒）或转染（噬菌体 M13 复制型 DNA) 合适的大肠杆菌感受态菌株。第二天随机挑选 12 个转化菌落或噬菌体 M13
噬斑进行少量培养。
31. 采用第 1 章或第 3 章描述的方法之一从 12 个培养物中纯化质粒、噬菌粒或噬菌体 M13 复制形式 DNA。用可从载体中切出靶片段的限制酶消化 DNA。
32. 通过凝胶电泳和大小合适的 DNA 分子量标准参照物分析从每种 DNA 中切出的靶片段的大小。
33. 如果结果是满意的（例如靶片段的大小在希望的范围内），可大量挑取相互独立的转化单菌落或噬斑。按上述方法鉴定插入片段的大小。保留携带大小符合的重组子培养物。
34. 通过 DNA 测序确定每种突变体缺失位点的准确部位（请见第 12 章方案 3、4 或 5)。
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