ELISA实验中常见出现问题及解决办法（二）
3.温育
3.1 由于ELISA试验在一定温度下的反应时间并不是反应的终点，温育时间过短、温度过低，易致显色不全；温育时间过长、温度过高，易致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底，产生阴性高值或假阳性反应。因此，要严格按规定的温度和温育时间进行。
3.2 由于水浴较难将温度控制在稳定的范围，因此我们每次试验时应认真观察水浴箱的温度，尽量少开启水浴箱门，严格控制水浴的温度为37±0.5。同时，微孔板不可重叠放置，以保证传热均匀，各板的温度都能迅速达到平衡。
3.3 由于试剂盒通常设定的反应温度为37度，在这个温度下温育一定时间，蒸发的水分会很多，对于整个反应体系来讲，各种反应物的浓度会不断地增加，这样必会导致反应*后的值升高。因此温育时应贴上封板胶。
4.洗板
洗板在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却是决定试验成败的关键。ELISA就是靠洗板来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的，通过洗板以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗板时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在ELISA操作中，洗涤是*主要的关键技术，应严格按要求洗涤。洗板如不彻底，有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标记抗体作用而产生干扰。
4.1 各厂家的洗液是根据各自试剂的条件配制的，因此采用不配套的洗液常会得到不正常的反应结果，包括本底升高，所以不同厂家的洗液不应混用。
4.2 洗液应按规定的倍数稀释使用。试剂盒提供的洗液是浓缩的，过多稀释洗液，会影响洗液的效果，而使反应的本底升高。反之造成假阴性。
4.3 稀释洗液的水应该是新鲜的蒸馏水，电导率小于1.5us/cm。如果水中含有过多的钙、镁离子，这些离子会占用表面活性剂，使试验本底增高。
