免疫亲和层析法测定黄曲霉毒素M1
1、范围
适用于测定牛奶、奶粉,以及低脂牛奶、脱脂牛奶、低脂奶粉和脱脂奶粉中黄曲霉毒素 M1 的含量。奶粉中的最低检测限是0.08μg/kg,牛奶中的最低检测限是0.008μg/kg。
2、原理
试样通过免疫亲和柱时,黄曲霉毒素 M1 被提取。亲和柱含有特性的抗体键合在固体支持物上。当样品通过亲和柱时,抗体选择性地与所有存在的黄曲霉毒素 M1(抗原)键合,形成抗体抗原复合体。停留在亲和柱上的所有样品上其他杂质用水清洗掉。然后用淋洗液将亲和柱上的黄曲霉毒素 M1 洗脱下来,收集洗脱液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪(HPLC)测定洗脱液中黄曲霉毒素 M1 含量。
3、试剂
除非特别声明,所用试剂为分析纯,使用蒸馏水、软化水或其他相当纯度的水。
①免疫亲和柱 免疫亲和柱应该含有黄曲霉毒素 M1 的抗体。亲和柱的最大容量不小于100ng 黄曲霉毒素 M1(相当于50mL 浓度为2μg/L 的试样)、当标准溶液含有4ng 黄曲霉毒素 M1(相当于50mL 浓度为80ng/L 的试样)时回收率不低于80%。应该经常检查亲和柱的技术性能,对于每个批次的亲和柱至少检查一次。
a.柱效检查 用移液管移取1.0mL 的黄曲霉毒素 M1 储备液到20mL 的锥形试管中。用恒流的氮气将液体慢慢吹干,然后用10mL10%的乙腈溶解干基质,用力摇荡。
将该溶液加入到40mL 的水中,充分混匀,全部通过免疫亲和柱。按要求使用亲和柱。淋洗亲和柱,洗脱下黄曲霉毒素 M1,将洗脱液进行适当稀释后,用 HPLC 测定亲和柱键合的黄曲霉毒素 M1 的含量。
计算黄曲霉毒素 M1 的回收率,将其结果与中所要求的指标进行对比。
b.回收率检查 用移液管移取0.8mL 0.005μg/mL 的黄曲霉毒素 M1 标准工作液到10mL 的水中,充分混匀,全部通过免疫亲和柱。按要求使用亲和柱。淋洗亲和柱,洗脱下黄曲霉毒素 M1,将洗脱液进行适当稀释后,用 HPLC 测定亲和柱键合的黄曲霉毒素 M1的含量。计算黄曲霉毒素 M1 的回收率,将其结果与①中所要求的指标进行对比。
②乙腈:色谱级。
a.乙腈水溶液(25%,V/V),将250mL 的乙腈与750mL 的水(使用前需要脱气)混溶。
b.10%的乙腈水溶液(V/V),将100mL 的乙腈与900mL 的水(使用前需要脱气)混溶。
③氮气。
④氯仿:加入0.5%～1.0%(m/m)的乙醇中进行稳定化。
⑤黄曲霉毒素 M1 标准溶液。
a.标准溶液 黄曲霉毒素 M1 标准溶液浓度为10μg/mL。根据下面的方法,在最大吸收波段处测定溶液的吸光度,以确定黄曲霉毒素 M1 的实际浓度。
用分光光度计,在340～370nm 处测定扣除氯仿的空白本底,读取标准溶液的吸光度值。在最大吸收波段处,(λmax=360nm)测得吸光度值为 A,根据下列公式计算出浓度值c1(μg/mL):
式中A——在 λmax 处测得的吸光度值。
M——328g/mol,黄曲霉毒素M1摩尔质量,g/mol;
m——1995m2/mol,溶于氯仿中的黄曲霉毒素 M1 的吸光系数,m2/mol。
b.标准储备液 确定标准溶液的实际浓度值后(⑤a.),继续用氯仿将其稀释至浓度为0.1μg/mL 的储备液。储备液应盖好盖,用铝箔包装好避光保存。
将储备液放在冰箱中5℃以下保存。在这种情况下,储备液可以稳定2个月。2个月后,应该对储备液的稳定性进行核查。
c.黄曲霉毒素 M1 标准工作液 从冰箱中取出储备液(⑤b.)放置至室温,然后移取一定量的储备液进行稀释制备成工作液。工作液当日使用当天制备。
黄曲霉毒素 M1 标准工作液配制:用移液管准确移取1.0mL 的储备液到20mL 的锥形试管中,用恒流的氮气将液体慢慢吹干,然后用20.0mL 10%的乙腈将干基质重新溶解,在30min 内经常振摇、充分混匀,配成浓度为0.005μg/mL 的黄曲霉毒素 M1 标准工作液。在用氮气对储备液吹干的过程中,一定要仔细操作,不能让温度降得太低,防止凝聚产生。
在做标准曲线时,注入 HPLC 的黄曲霉毒素 M1 量分别为0.05ng,0.1ng,0.2ng和0.4ng.根据 HPLC 进样量,用工作液可以配制一系列适当浓度的黄曲霉毒素 M1 标准溶液,稀释液用10%的乙腈。
4、仪器设备
使用实验室通用仪器设备,特殊情况说明如下。
①一次性注射器:10mL和50mL。
②真空系统。
③离心机:离心力4000g。
④移液管:1.0mL,2.0mL和50.0mL。
⑤玻璃烧杯:250mL。
⑥容量瓶:100mL。
⑦水浴:能在30℃±2℃,50℃±2℃,35～37℃之间温度段使用。
⑧滤纸。
⑨有刻度的锥形玻璃试管:带玻璃磨口的瓶颈和瓶塞,容量为5mL,10mL,20mL。
⑩高效液相色谱仪。
a.无脉冲泵:可以调节到恒体积流量为1mL/min。
b.进样系统:具有固定进样量,进样体积从50μL至500μL。
c.反相色谱柱:填充3μm 或者5μm 的十八烷基硅胶,加填充有反相材料的保护柱。
d.荧光检测器:能够产生365nm 的激发波长、435nm 的发射波长,在适当的色谱条件下能够测定0.02ng 的黄曲霉毒素 M1(相当于5倍噪音)。
e.记录仪:带打印机或标绘器、或者电子积分仪、或者计算机数据处理系统。
①分光光度计:波长范围为200～400nm,带1cm 的石英比色池。
天平:能够称量到0.1g,可读至0.01g。
5、采样
实验室收到的样品应该具有真正的代表性,在运输的过程中没有被损坏和变性。
6、分析步骤
①概述 所有的操作分析均应尽可能地在避光条件下进行。
对于用奶粉冲制的牛奶,使其通过免疫亲和柱,然后清洗、淋洗亲和柱。亲和柱的制造商规定的操作方法稍有差异,分析人员应该严格地按照说明书进行分析操作。通常的分析步骤包括:用水或者盐水缓冲液将奶粉冲制成牛奶,离心分离后在一定压力的作用下使牛奶样品通过亲和柱(可能需要预清洗)、用水清洗亲和柱、用甲醇或乙腈将黄曲霉毒素M1从亲和柱上洗脱下来。在操作过程中,特别要注意各种液体通过亲和柱的流速。
②试样制备
a.牛奶将牛奶样品在水浴中加热到35～37℃。用滤纸过滤(根据情况,也许需要用几种不同规格的滤纸进行过滤),或者在4000g下离心15min。至少收集50mL的牛奶试样,按照④继续进行分析。
b.奶粉称取10g 样品(精确到0.1g)置于250mL 的烧杯。将50mL 已预热到50℃的水每次少量地加入到奶粉中,用搅拌棒将其混合均匀。
如果奶粉不能完全地溶解,将烧杯在50℃的水浴中放置30min,仔细混匀。
将牛奶溶液冷却至20℃后,用少量的水将其全部转移到100mL 的容量瓶中,再用水稀释至刻度。用滤纸过滤,或者在4000g 件下离心15min。至少收集50mL 的牛奶试样,按照④继续进行分析。
③免疫亲和柱的准备 将一次性的50mL 注射器筒与亲和柱的顶部相连,再将亲和柱与真空系统连接起来。
④样品的提取与纯化 用移液管移取50mL 的试样到50mL 的注射器筒中,使它们以2～3mL/min 稳定的流速通过亲和柱,流速可以通过真空系统控制。
取走50mL 的注射器筒,并用干净的10mL 注射器筒代替。然后用10mL 的水进行清洗,水的流速应该保持稳定。清洗后,让亲和柱的下部分完全干燥。
使亲和柱与真空系统脱离后,将4mL 乙腈加入到10mL 的注射器筒中将亲和柱上的黄曲霉毒素 M1 淋洗下来。所有4mL 乙腈通过亲和柱的时间至少需要60s,流速可以通过注射器的柱塞来控制。将洗脱液收集于锥形试管中,然后用恒流的氮气在30℃下将洗脱液吹干至体积为50～500μL(注意:如果蒸发至完全干燥,则会造成黄曲霉毒素M1的损失),体积数为 V,用水将其稀释10倍至最终体积数为 V(即500～5000μL)。(注意:如果注入HPLC 的含有黄曲霉毒素M1的样品中乙腈含量超过10%,色谱峰变宽。如果水的含量超过90%,则对色谱峰的形状没有影响。)
⑤高效液相色谱分析仪
a.泵 以恒定流速将洗脱液泵流通过 HPLC 柱。如果需要(根据所用色谱柱的型号),调整HPLC 洗脱液中乙腈/水的比例,以保证使黄曲霉毒素 M1 与其他成分的分离效果最佳。洗脱液的流速根据所用色谱柱的型号不同而有所差异。对于普通色谱柱(柱长约25cm、柱内径约4.6mm)而言,流速在1mL/min 左右,效果最好;柱内径约4.6mm 时,流速在0.5mL/min左右,效果最好。
为了确定最佳的色谱条件,可以先将样品提取液(最好不含有黄曲霉毒素 M1)注入HPLC,然后再注入提取液与黄曲霉毒素 M1 标准溶液的混合液。
b.色谱性能 标准曲线的线性度和色谱系统的稳定性需要经常检查,多次反复地注入固定量的黄曲霉毒素 M1 标准溶液, 直至获得稳定的峰面积和峰高。相邻两次峰面积和峰高的差异不得超过5%。
黄曲霉毒素 M1 的保留时间与温度有关,所以对测定系统的漂移需要补偿。过一段时间注入固定量的黄曲霉毒素 M1 标准溶液,这些标准溶液的测定结果可以根据漂移的情况进行校正。
c.黄曲霉毒素 M1 的标准曲线 根据 HPLC 进样量,选择适当的体积数为Ve,分别注入含有0.05ng,0.1ng,0.2ng和0.4ng的黄曲霉毒素M1标准溶液。绘制成峰面积或峰高对黄曲霉毒素 M1 质量数的标准曲线。
d.样品洗脱液的色谱分析及进样方案 通过进样环将适量体积 Ve,洗脱液注入 HPLC。采用与标准溶液相同的色谱条件分离出洗脱液中的黄曲霉毒素M1。标准溶液和样品洗脱液均按照规定的方案进样。当检测一系列连续样品时,建议每隔5个样品,加测一个黄曲霉毒素M1 标准溶液。
根据样品洗脱液色谱图中黄曲霉毒素 M1 的峰高或峰面积值,从标准曲线上查出注入的样品洗脱液中所含有的黄曲霉毒素 M1 质量数(ng)。
如果样品洗脱液的黄曲霉毒素 M1 的峰面积或峰高值高于标准溶解,用水定容稀释样品洗脱液后,重新进样分析。
7、测定结果的计算与表示
①牛奶
a.计算 应用下式计算被测样品中的黄曲霉毒素 M1 的含量m,单位为μg/L。
式中mA——根据样品洗脱液的黄曲霉毒素M1的峰面积或峰高,从标准曲线上查得的黄曲霉毒素M1的质量数,ng;
Vi——注入样品洗脱液的体积数,μL;
Vf——样品洗脱液的最终体积数,μL;
V——通过亲和柱被测样品的体积数,mL
b.测定结果的表示 测定结果单位以 μg/L 表示,精确到小数点后三位。
②奶粉
a.计算 应用下式计算被测样品中的黄曲霉毒素 M1 的含量 Ωp,单位为μg/L
式中,m 为50mL 样液中所含有的奶粉质量数,g;mA,Vf,Vi的含义与(7)①a.中所定义的一样。
这个公式仅仅适用于被测溶液没有稀释的情况,如果需要稀释,则应该将稀释倍数计算进去。
b.测定结果的表示 测定结果单位以 μg/kg 表示,精确到小数点后三位。
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技术原理
