微柱筛选法测定各种食品中黄曲霉毒素
(1)原理
样品提取液中的黄曲霉毒素被微柱管内硅镁型吸附剂层吸附后,在波长365nm 紫外光灯下显示蓝紫色荧光环,其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的浓度范围内成正比例关系。若硅镁型吸附剂层未出现蓝紫色荧光,则样品为阴性(方法灵敏度为5～10μg/kg)。由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2,所以测得结果为总的黄曲霉毒素含量。
(2)试剂
①甲醇。
②甲醇-水溶液(55+45)。
③正己烷或石油醚:沸程30～60℃或60～90℃。
④三氯甲烷。
⑤丙酮。
⑥中性氧化铝:层析用,100～200目与200～300目。
⑦酸性氧化铝:层析用,100～200目。
⑧⑨硅镁型吸附剂:层析用,100～200目。
⑨无水硫酸钠:作层析用的需加工过筛成80～100目、60～100目与40～80目三种。
⑩脱脂棉。(注:作层析用的酸性与中性氧化铝、硅镁型吸附剂及层析用无水硫酸钠应在110～120℃活化2h,装瓶盖严于干燥器内保存备用,保持1周左右。)
①黄曲霉毒素 B1 标准使用液:用三氯甲烷配制每毫升分别相当于0.0025μg 与0.0050μg的黄曲霉毒素 B1 标准液。
(3)仪器
①紫外光灯:100～125W,带有波长365nm 滤光片。
②玻璃微柱管:内径0.4cm,长12cm,为便于加液可在管的上部接一段粗的管口。
③微柱层析架:附有接受洗脱废液的容器,要尽可能密闭。
(4)测定方法
①提取
花生油 称取5g 混匀的样品,置于小烧杯中。用25mL 石油醚将样品移于100mL 分液漏斗中,再用25mL 甲醇水溶液,分次洗涤烧杯,一并加入100mL 分液漏斗中。振摇2min,待静置分层后,将下层甲醇水溶液放入50mL 具塞量筒或比色管中。加入10mL 三氯甲烷,振荡2min,加水至50mL,轻轻翻转4次,以促使其分层,打开塞,待分层后,用连接水泵装置的滴管抽去上层的甲醇-水溶液。再加水至50mL,轻轻翻转4次,洗去残留的甲醇。再同上法将上层水抽掉,加入4g 无水硫酸钠,盖严,间断摇动10min,即为样品提取液,此样液每毫升相当于0.5g 样品。
花生 称取20g 磨细过10目筛孔混匀的样品,置于250mL 具塞锥形瓶内。加100mL 甲醇-水溶液与30mL 石油醚。并在塞上涂一层水,盖严防漏,振荡30min。过滤时,先用力摇匀后,立即将样液大量地倒入放有折叠式的约8.5cm 直径的快速定性滤纸的漏斗中滤入50mL量筒或比色管中,注意勿将上层石油醚带进滤液中。收集25mL 甲醇-水溶液然后加入10mL 三氯甲烷,振荡2min 打开塞,待分层后,将上层甲醇-水抽掉,加水至50mL,轻轻颠倒4次,洗去残留的甲醇。再同上法将上层水层抽掉,加入4g 无水硫酸钠盖严,间断摇动10min,即为样品提取液,此样液每毫升相当于0.5g 样品。
玉米 称取20g 磨细、过20目筛孔的混匀样品,置于250mL 具塞锥形瓶中,加入4mL水使样品湿润后,再加入40mL 三氯甲烷振摇30min,然后加入10g 无水硫酸钠,摇匀放置10min,使之脱水,经折叠式快速定性滤纸滤于具塞试管中,此即样品提取液,此样液每毫升相当于0.5g 样品。
②测定
微柱管I的制备(供花生油、花生提取用)取微柱管于微柱架上按先后顺序加入下列各试剂,脱脂棉(作底层),1cm 80～100目无水硫酸钠,0.5cm 硅镁型吸附剂,0.5cm 80～100目无水硫酸钠,1cm 中性氧化铝,1cm酸性氧化铝,1.5cm 40～80目无水硫酸钠。装管时管要垂直,每装一种试剂要适当敲紧,两种试剂之间界面要平,柱管要随装随用,或装好后立即放于干燥器内保存,等所需的柱装完后再一起上样液。以免吸附剂暴露于空气中的时间较长,降低活性。
微柱管Ⅱ的制备(供提取玉米用)装柱方法同微柱管I的制备方法。按先后顺序加入下列各试剂,脱脂棉(作底层),0.5m 60～100目无水硫酸钠,0.5cm 硅镁型吸附剂,0.5cm 60～100目无水硫酸钠,2～2.5m中性氧化铝,1cm 60～100目无水硫酸钠,脱脂棉(铺顶层)。
微柱层析 取装好的微柱管I或Ⅱ,加入1mL 提取的样液,另取2支加入1mL 每毫升相当于0.0025μg 及0.0050μg 的标准使用液,相当于样品的浓度依次为5μg/kg,10μg/kg 另取1支加人1mL三氯甲烷作为标准空白管,待加液流至顶层时,即加入1mL丙酮三氯甲烷展开剂(1+9)展开,在加样或展开时,柱管均要保持垂直,待展开剂流完后,即可观察结果,最好在2h 内进行观察。
结果观察与评定 在365nm 波长紫外光灯下,将层析后的样品微柱管依次与0,0.0025μg,0.0050μg 的黄曲霉毒素B1标准柱管比较,若样品柱管内硅镁型吸附剂层只出现微黄色荧光环,则样品中黄曲霉毒素含量为未检出(在5μg/kg 或10μg/kg以下);若出现蓝紫色荧光环,则表示样品中黄曲霉毒素含量可能超过了5μg/kg 或10μg/kg,需要用其他的分析方法作进一步的测定确认。
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