DNA测序技术（非同位素银染测序系统操作技术与T7 DNA...4
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录，则可用EDF胶片保留实验结果。
[注意] 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响。
1. 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得较好的效果，如果水中有杂质，则低分子量条带可能无法出现。
2. 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可获得较好的结果。
3. 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA ，产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。
4. 如果凝胶厚度超过0.4mm或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5 秒。
5. 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。
（五）、EDF胶片显影
使用EDF胶片可增强测序条带的对比度，如果测序胶上条带很淡，我们建议把数据转移至EDF胶片，银染胶在其影像转移至EDF胶片之后可增强条带可读性。
1. 在暗室内，将染色过的粘于玻璃板的凝胶(胶面向上)置于荧光灯箱上。如有合适的漫射板，亦可用白灯箱，为确保曝光时间，用一小条EDF胶片曝光不同时间，检查不同的曝光强度，一般曝光20--40秒可得较好结果。
2. 在红灯下找到EDF胶片有缺刻的一角，然后把胶片置于凝胶上，使缺口位于左上角。由于EDF胶片是单面的，因此必须确保缺口在左上角。
3. 在EDF胶片上放置一干净、干燥的玻璃板，开亮灯箱约20秒。
4. 用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影EDF胶片，可使用下列操作过程:
a. 在Kodak GBX显影液中显影1-5分钟;
b. 水洗1分钟;
c. 在Kodak GBX定影液中定影3分钟;
d. 水洗1分钟.
[注意] 1. 进行EDF胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作，以免印上指纹。同时注意EDF胶片不能用自动胶片处理器。
2. 对于不同的光源最佳曝光时间可能不同，通过对一小条EDF胶片曝光不同时间以选择你所用光源的最佳曝光时间，参阅胶片说明书。
3. 曝光时间短则EDF胶片影像较深，曝光时间长则有助于减弱背景。
第二节 T7 DN A聚合酶测序技术
一、概述
T7 DNA 聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及单链和双链3'→5'外切酶活性。当T7 DNA 聚合酶用适当方法处理后，可使3'→5'外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA 聚合酶又称T7测序酶。
使用T7测序酶得到的测序数据具有在每个碱基位置都有相对均匀的配对参入。因此，放射自显影所得到的结果较为清晰易辩，对于许多模板来说，使用含有
dGTP的混合物即可得到理想的测序结果。然而，如果出现了带压缩的问题，则用含dITP的混合物来取代常规的dGTP。dITP的掺入，使在富含GC的模板中也能有效地消除带压缩现象。
T7测序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延续性，正因如此，该酶在使用中不同于Klenow片段和反转录酶。它几乎没有错误性的终止，整个反应在很短的时间内完成，并且不需要进行追加反应(Chase
step)。 然而对于有紧密二级结构的区域，错误的终止反应会给阅读序列带来困难。如果碰到这些情况，应使用一些高温DNA
聚合酶，如Promega公司的测序级Taq DNA 酶。利用高温DNA 聚合酶独有的耐热特性，测序反应可在不利于形成二级结构的高温条件下进行。
T7 DNA
聚合酶测序的快速而简便的方法是从Klenow酶和AMV反转录酶测序的操作步骤修改而来的，它的最大优点是具有很高的5'-3'的DNA
合成活性和极低的3'-5'端外切酶的活性。在测序过程中，若以同位素标记则相对于大肠杆菌DNA
聚合酶Ⅰ的大片段Klenow，或反转录酶AMV而言，则可使条带非常的均一，并且它的放射性背景极低。
T7 DNA 聚合酶测序时DNA 的合成的过程是分二步完成的。第一步为标记反应阶段，第二步方为双脱氧链末端终止的DNA
合成过程。在第一步过程中，引物的延伸是在较低浓度的脱氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反应过程中，已含有经放射性标记的dATP。第二步过程中，脱氧三磷酸核苷酸浓度提高，并且加入双脱氧的三磷酸核苷酸，DNA
在合成过程中，因加入的双脱氧三磷酸核苷酸而随机终止，形成长短不一的DNA 片段。
