DNA测序技术（非同位素银染测序系统操作技术与T7 DNA...7
在分子生物学研究中，DNA
的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和
Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生
A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA
序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。
Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA
聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在
G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
第一节 非同位素银染测序系统操作技术
一、概述：
Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA 测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。
银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。
此外，SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物，
减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。
Taq DNA 聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA 聚合酶是一种Taq DNA 聚合酶的修饰产品，对于双链DNA 模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。
退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR
产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃
退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。
由于本系统采用热循环装置，与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA
产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03--2pmol模板DNA ，随模板种类而定。(2).
在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA (dsDNA )模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA
模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA 模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。
二、材料 待测已提纯的DNA ，可为单链，也可为双链。
三、设备 高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR仪。
易生物仪器库：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
四、试剂
（1）SILVER SEQUENCETM DNA 测序试剂盒。
（2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，0.45mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。
（3）10%过硫酸铵，0.5g过硫酸铵溶于4ml水中，定容至5ml，应新配新用。
（4）10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris，0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g
Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ・2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于 4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。
（5）TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。
（6）TEMED
（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。
（8）染色溶液：硝酸银2克，甲醛3ml，溶于2升超纯水中备用。
（9）显影溶液：60克碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml)。
（10）95%乙醇。
（11）0.5%冰乙酸。
（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。
五、操作步骤：
成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA 模板量，每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点：
（1） DNA 的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定，样品应与已知量DNA 一起电泳。
（2） 分光光度法对于很多DNA 提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA 浓度估计，混杂的染色体DNA 、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA 浓度。
（3） DNA 制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA 样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm光吸收。
（一）测序反应：
1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。
2. 对于每组四个测序反应，在一个eppendorf管中混合以下试剂：
（1） 样品反应：
质粒模板DNA 2.1pmol
5×测序缓冲液 5ml
引物 4.5pmol
无菌ddH2O 至终体积16ml
（2）对照反应
pGEM-3Zf(+)对照DNA (4mg) 4.0ml
5×测序缓冲液 5ml
pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml
无菌ddH2O 至终体积 16 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA 聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。
4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。
5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。
7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA 测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。
[注意] 1、测序所用模板DNA 的量一般按下面要求加入：
| 模板种类/长度 | 模板量 |
| 200bp (PCR产物) | 16ng(120fmol) |
| 3000-5000bp（超螺旋质粒DNA ) | 4mg (2pmol) |
| 48000bp(λ，粘粒DNA ) | 1mg(31fmol) |
由于超螺旋质粒产生的信号比松驰的线性双链DNA 弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。
2、计算与4.5pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式：
4.5pmol=1.5ng×n，其中n为引物碱基数
计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式：
dsDNA :1pmol=(6.6×10-4 mg)×n，其中n为模板碱基对数
ssDNA :1pmol=(3.3×10-4 mg)×n，其中n为模板碱基数
