ICSH关于裂片红细胞的定义、计数与临床应用价值
裂片红细胞是指红细胞在血液循环中被机械性破坏后产生的细胞碎片。裂片红细胞检查对血栓性微血管病性贫血（TMA）的诊断提供重要形态学线索。然而，红细胞碎片性质和形态变化异质性及对其形态判定的主观性和多样性，各个实验室的报告标准尚未统一。常因缺乏统一标准导致结果不一致或错误，从而影响治疗和临床结果。
裂片红细胞是指血液循环中的红细胞碎片或是胞浆部分缺失的红细胞。正常健康人群血涂片中不见或罕见。外周血中出现裂片红细胞，尤其无其他红细胞形态异常的情况时，应立刻检查患者是否存在血栓性微血管病性贫血。血栓性微血管病性贫血主要分为血栓性血小板减少性紫癜（TTP）和溶血性尿毒症（HUS）。TTP一直因缺乏直接和特殊的治疗方法，其预后极差。近来早期血浆置换成为TTP安全有效的治疗方法，因此未出现明显症状之前，裂片红细胞计数的重要性不言而喻。同时TMA是造血干细胞移植术后的主要并发症，裂片红细胞计数也已成为移植后患者监测的新手段。
裂片红细胞也和心脏、大血管的结构异常有关，如人工心脏瓣膜、HELLP综合症、恶性高血压和肿瘤转移等情况下导致红细胞被机械性破坏后的常见结局。有些红细胞碎片与裂片红细胞形态相似，但主要见于非TMA相关的遗传性或获得性红细胞疾病（如红细胞膜缺陷、地中海贫血、巨幼细胞性贫血、原发性骨髓纤维化和灼伤），这些疾病中红细胞碎片形态呈现高度多样性并伴随显著的红细胞大小不均和形态异常，不能作为TMA诊断的特征性形态变化。
外周血涂片经标准染色操作和显微镜观察来检查裂片红细胞。对于辨识与计数裂片红细胞的形态标准尚未统一，实验室与镜检工作人员之间对细胞形态判别与报告方式存在诸多差异，缺乏标准导致诊断意见不统一，最终影响治疗与临床效果。尽管红细胞碎片的检测具有直观性，但仍缺乏裂片红细胞的统一定义。裂片红细胞计数的特殊要求，镜检人员之间偏差。除细胞识别标准不一致外，差异还来于计数方法、涂片观察位置、计数红细胞总数、计数使用的辅助工具如米勒计数板、报告方式多样性。为降低镜检人员间差异及提高计数的准确性与重复性，法国形态学专家组着手建立裂片红细胞辨识与计数的统一规则。此外，新一代血球计数仪已经可以自动化计数红细胞碎片，作为TMA相关疾病一项筛选裂片红细胞检查的手段，方法敏感性较高，但特异性有待提高。裂片红细胞计数还作为一项造血干细胞移植中TMA预后评价指数，临床实验室采用标准方法定量计数裂片红细胞显得尤为重要。
为提高裂片红细胞计数的准确性与重复性，以更好地用于TTP和TMA相关疾病的诊断，在2008年11月国际止血与血栓委员会成立了国际裂片红细胞工作组，该组织主要目的如下：
① 明确裂片红细胞的形态标准；
② 裂片红细胞计数方法的标准化；
③ 确定TMA诊断的统一报告界值；
④ 自动血细胞分析仪红细胞碎片计数的可靠性和临床应用评价。
显微镜检查裂片红细胞的ICSH指南
一、根据特定的形态标准来确定裂片红细胞
裂片红细胞识别与分类的不统一是裂片红细胞计数重复性差的一个主要原因。文献描述的裂片红细胞往往形态变异、不一致性，包括不规则畸形红细胞、异形红细胞、锯齿状红细胞、不典型高色素性球形红细胞、红细胞淡影等。ICSH工作组讨论时出现两种观点：1）是否按照名称将所有形状的红细胞胞浆小碎片归为裂片红细胞；2）或是哪些特定形态的红细胞碎片才能认为裂片红细胞。最后经讨论与文献复习，工作组一致认为使用明确形态学标准，以确定一些主要裂片红细胞类型；对裂片红细胞的来源达成共识，即来源于红细胞碎片或是被切割的红细胞；裂片红细胞形成机制是红细胞膜被内皮细胞表面的纤维蛋白丝机械性损伤，或是血液中产生大量漩涡振荡所致。
根据ICSH裂片红细胞形态学标准，确定以下几种类型：
1）形状各异的小碎片：有的呈尖角或三角形，边缘一侧呈笔直切缘或一侧呈圆形轮廓（小新月形），常畸形，深染，偶尔因碎裂时血红蛋白丢失呈苍白色；小新月形红细胞需与镰刀状红细胞鉴别；
2）盔形红细胞：往往细胞一侧边缘被切割成较平整切缘的破损红细胞，相应丢失的细胞成分也是碎片。
3）体积较小碎片大的破碎细胞：这种细胞往往在破损一侧膜呈现部分凹陷，边缘两端有一对尖角突起，有时为两对甚至三对，通常把这种细胞称之有角红细胞。血液中常与三角形、新月形、盔形红细胞一起出现。葡萄糖6磷酸酶缺陷时由于海恩氏小体被巨噬细胞吞噬清除后，往往形成水泡细胞，出现形态与有角红细胞相似的细胞：其通过病史回顾可与有角红细胞区别。
4）体积小、深染的红细胞：称为小球形红细胞。小球形红细胞中央淡染区消失，是细胞碎片形成过程中的一种继发形态表现。须在以上3种碎片类型存在情况下才能作为裂片红细胞计数。与红细胞维持细胞体积而减少细胞膜表面积有关，或是其他裂片红细胞的形态改变，主要出现在靠近涂片尾部分布均匀区域。尽管小球形红细胞与遗传性球形红细胞增多症/免疫性溶血时出现的球形红细胞在形态与名称上部分重叠，需要鉴别的是后两者情况下红细胞直径轻度变小。
二、标准程序进行显微镜检查，裂片红细胞计数结果以百分比形式报告
通过光学显微镜观察周围血涂片，进行裂片红细胞的辨识与计数。按照ICSH及国际研究认可的标准化操作程序，血涂片应平铺展开、迅速干燥、固定及染色。亦可使用全自动血片推片与染色仪。裂片红细胞定量评估对患者的诊断与监测具有重要意义，选择血涂片合适区域计数1000个红细胞得到裂片红细胞的百分比。然而只有在裂片红细胞是主要形态异常时才能定量评估裂片红细胞。
Rümke等人通过观察100至10000个红细胞，提出了裂片红细胞百分比95％可信范围。ICSH裂片红细胞工作组基于计数结果的准确性与检查所需时间综合考虑后，认为计数1000个红细胞比较合理。该数字也经过专家组成员的实践后验证。为避免标准不统一所带来的计数不准确性，细胞形态标准必须标准化。
不同区域观察影响裂片红细胞的判断。带尖角的碎片容易出现在涂片尾部边缘。故应在涂片体尾交界、厚薄适宜、红细胞散在分布的区域进行计数。显微镜观察应该使用中倍放大观察，即使用40，50，60倍物镜，必要时可以使用油镜，与10倍或12.5倍的目镜。这样很容易在几个视野里观察到所有形状异常的红细胞。
三、裂片红细胞计数在TMA或相关性疾病中具有特殊的诊断价值
红细胞碎片来源：
1）小血管内纤维蛋白丝机械性损伤如TMA，同样心脏、外来物质重构的大血管或病理情况，或肾脏透析回路内血液涡流、鞘液压力、红细胞粘附于异常内皮细胞。
2）细胞骨架异常和细胞膜碎片，主要见于遗传性或获得性红系造血发育不良疾病。
3）灼伤患者红细胞膜热损伤，导致球形红细胞和小球形红细胞形成，破裂的细胞碎片大多呈球形，有时带尖角的破碎红细胞。
然而ICSH工作组一致认为TMA时第一种机制与裂片红细胞形成相关。
四、临床实践中裂片红细胞是红细胞主要的异常形态时，其计数才有价值
红细胞碎片主要是红细胞内在缺陷而产生的，有些红细胞碎片与裂片红细胞在形态学上存在重叠，进行裂片红细胞计数时一定要注意裂片红细胞是否为主要形态异常，而不是其他疾病伴随出现的一种形态异常。如果其他病理情况出现：如氧化导致红细胞破坏、遗传性热性红细胞增多症，此时裂片红细胞计数失去了相应意义。极少情况下骨髓增生异常综合征也会出现碎片红细胞和血小板减少现象，此时不能误诊为TMA。
因此ICSH专家组认为诊断TMA进行裂片红细胞计数时，应全面评价红细胞的整体形态。TTP及相关疾病时，观察裂片红细胞为主要形态异常，有时伴中度红系造血增生表现：如多色素性红细胞、嗜碱性点彩红细胞、有核红细胞等出现。对这类伴其他各种异常形态红细胞为背景时，血涂片中出现裂片红细胞，ICSH建议只需提供定性结果。而定量结果适用于病人监测，如造血干细胞移植相关TMA。最终报告需强调裂片红细胞是否为主要红细胞形态异常，或是红细胞形态大小不均、以及伴有其他红细胞形态异常中的一部分，此时提示可能为其他诊断。后者诊断TMA可能性较小且需要其他辅助检查确诊。
根据ICSH裂片红细胞工作组建议球形红细胞、泪滴状红细胞、不规则皱缩红细胞、棘红细胞、锯齿状红细胞和咬痕红细胞都是细胞氧化破坏后的形态改变，不应计数为裂片红细胞。特别是咬痕红细胞是海恩氏小体通过脾脏清除后形成的。葡萄糖6磷酸脱氢酶缺陷、不稳定血红蛋白病或溶血危象，咬痕红细胞常伴随不规则皱缩红细胞，深染锯齿状红细胞和红细胞淡影出现。然而，ICSH工作组发现部分学者认为有角红细胞、盔形红细胞、咬痕红细胞是同一类型的细胞碎片。热性异常红细胞增多症中极小且圆形、不规则、新月形或畸形红细胞和红细胞小泡也不应该计数为裂片红细胞，如在一些红细胞显著增生异常情况，骨髓纤维化时释放入血液、严重烧伤或化学损伤时产生。有时烧伤、地中海贫血、原发性骨髓纤维化、巨幼细胞性贫血、先天性环铁粒幼细胞和红系增生异常性贫血，长期缺铁性贫血和骨髓增生异常综合征时可与典型裂片红细胞一起出现。当然这种情况还存在一些困惑，异形红细胞增多和畸形的碎片在形态学上接近或甚至与典型裂片红细胞不能区别。裂片红细胞在其他DIC或败血症中会有少量出现，但是这些情况下计数裂片红细胞缺乏其特殊的诊断价值。
五、裂片红细胞比例大于1%是诊断成人TMA的充分形态学依据
因裂片红细胞形态缺乏统一认识，各实验室报告范围差异很大。文献对裂片红细胞报告范围上限也未达成一致，一般建议小于1%。Burns等人曾提出正常人的范围上限为0.2%，肾衰患者为0.6%，先兆子痫为0.45%，人工心脏瓣膜正常功能者为0.48%，所有6位TTP患者范围1.1%～9.4%。Leseve等人发现119位正常对照中最大值是0.19%。
ICSH工作组认为当缺乏证据提示其他疾病诊断时，外周血涂片裂片红细胞比例大于1%是充分的形态学证据有助于成人TMA诊断。偶尔裂片红细胞会延迟数日出现于外周血中，此时对高度怀疑TMA而血片未见裂片红细胞时，就应每日复查周围血片查找裂片红细胞。罕见数情况下TMA整个发病过程中外周血片可无裂片红细胞。然而移植相关TMA诊断时一般采用较高界值，国际工作组建议界值为4%（伴有血小板减少、乳酸脱氢酶升高、血红蛋白降低、促珠蛋白降低）。
刚出生新生儿红细胞碎片较多见占1.4～1.9%，早产儿高达4.9～5.5%。目前ICSH的建议仅适用于成人。
六、自动化血细胞分析仪计数红细胞碎片可获得较高的阴性预期值，是显微镜检查的有力补充
所有新型自动化血细胞分析仪都带有红细胞碎片报警提示，有些仪器通过对EDTA抗凝血样本检测后，进行前向散射和荧光强度测量或二维光学分析，自动提供红细胞碎片计数。
自动化红细胞碎片计数作为常规筛选中一项新的有意义参数，具有低成本和检测时间短特点。尤其在高碎片红细胞比例时重复性好，24小时内稳定。TMA或移植后患者裂片红细胞计数显示良好的相关性。然而，与手工法红细胞碎片计数结果相比，目前现有两种方法中一种可能会出现结果轻度偏低，而另一种仪器则会轻度偏高。红细胞平均体积大于105飞升时会出现假阴性结果，可能是仪器将大红细胞碎片计数入微小红细胞。TMA诊断的敏感性和特异性与所选择的界值不一而有所不同，但报道的阴性结果预期值很高。
按照工作组和专家成员的个人经验和已报道的研究，ICSH裂片红细胞工作组确定常规实验室中使用自动化碎片红细胞计数作为一种筛选方法。所有自动化碎片红细胞计数结果阳性以及自动化红细胞计数结果阴性的大红细胞样本都必须进行显微镜检查确认。自动化碎片红细胞计数的一个主要优势是，便于对真阳性样本进行准确和密切随访。
参考文献：G. ZINI ET AL. ICSH RECOMMENDATIONS FOR DETECTION AND QUANTITATION OF SCHISTOCYTES.Int. Jnl. Lab. Hem. 2012, 34, 107–116.
