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翻译后修饰蛋白质的定性和定量实验2

2019.3.28

二、用于鉴定 P T M 的富集技术

2.1 磷酸化

丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的可逆磷酸化也许是研究最为深人的 PT M 。蛋白质磷酸化信号网络介导细胞对与不同的应激因子、生长因子、细胞因子以及细胞间相互作用作出响应。憐酸化还影响多种细胞进程，如增殖、凋亡、迁移、转录和蛋白质翻译（W hite，2008)。在肿瘤、自身免疫疾病、代谢紊乱和传染性疾病中都涉及蛋白激酶和磷酸酶的异常调节（Blume-Jensen and H unter， 2001; Gatzka and Walsh， 2007; Sirard et al. ， 2007;T aniguchietaL ,2006)。一个磷酸化反应事件就会对细胞进程产生剧烈影响。例如, 养分剥夺、环境应激、某些小 R N A 病毒感染都会激发 eIF4E-结合蛋白的去磷酸化，进而导致 eIF4E-结合活性显著提高, 从而抑制翻译(Gingras et al. , 2001)。

传统的鉴定磷酸化位点的手段包括使用32P-标记的 ATP(32P-Iabeled ATP) 或磷酸共培养细胞。磷酸化蛋白质组会摄取生长培养基中的放射性磷, 继而通过一些手段，如 2I>GE或高效液相色谱 (HPLC) 检测具有放射性的蛋白质。分离得到的蛋白质会被水解。所得的磷酸肽在 TLC 板中分离，随后利用 Edman 降解法进行测序。然而，这些方法非常费时，并需要大量相对纯的磷酸肽，而且必需使用大量放射性材料 (McLachlin and Chait，2001)。

由于以上缺陷，基于质谱的蛋白质组学迅速崛起，成为鉴定磷酸化的首选方法。近期—个蛋白质组研究通过比较大肠杆菌 co「）、乳酸菌< X ac(ococo« Zac汾）和枯草芽孢杆菌 )发现, 在介导碳代谢作用的糖酵解途径中的几乎所有的酶都在不同的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基发生了磷酸化 (SouH et al. , 2008)。有趣的是，他们还发现检测出的磷酸化位点表现出的进化保守性远远高于一级序列（Soufi et al. ，2008 ) 。另一个研究小鼠肝脏磷酸化蛋白质组的结果发现，虽然鉴定出的许多磷酸化位点在 Swiss-P ro t数据库中已有注释(Pan et al. ， 2008)，然而鉴定位点中半数以上是新的，说明小鼠磷酸化蛋白质组中可能仍有许多磷酸化位点有待发现(Pan et al. , 2008)。

质谱法能够从复杂的蛋白质混合物中鉴定出特定的磷酸化位点，但是这种方法也确实会有一些问题，如在样品量有限、样品复杂度高或样品中蛋白质浓度动态范围广的蛋白质组学应用中时(White, 2008)。而将这些困难更为复杂化的是，磷酸化通常是亚化学计量的，因此一个蛋白质来源的磷酸肽的浓度比其他肽段的浓度都要低。大量未修饰肽段抑制了质谱对憐 fe肤的反应。. 这个现象会导致目的憐酸肤检测信号的缺失（McLachlinand C h a k , 2001)。这可以通过多种富集技术减少与 P T M 变体相关的未修饰肽段含量，从而减少这种抑制性假象 (suppression artifact) 。

其中一种应用于憐酸化鉴定的帛集技术是使用强阳离子交换（strong cationexchange,S C X )树脂来选择性分离磷酸肽。研究发现, 在 p H 小于 2.6 时，胰蛋白酶消化的磷酸肽不能被S C X 颗粒保留（BeausoleiletaL , 2004)，这可能是由于磷酸基团荷载了更多的负电特性。 S C X 柱的流穿液可以用反相(R P )色谱柱分离，并用质谱分析 (Lim andKassel， 2006)。这种将磷酸肽从未修饰的相似物中分离出来的方法, 可以帮助减轻上述的质谱检测中的抑制问题。这种富集技术的优势在于既能在线（on— line)也能离线（offline)分离。而劣势之一是它依赖于 S C X 树脂与磷酸肽的不可结合性，这点与其他一些通过与磷酸化残基结合，并因而能够选择性地富集磷酸肽的方法不同。

固定化金属亲和层析 (I M A C )是一种运用最为普遍的从复杂的消化蛋白质混合物中选择性分离磷酸肽的方法。这种方法通常利用一种金属螯合介质来结合三价金属离子，如 Fe34或 G a 3+ ( S y k o r a et al. ，2007)。这种带电树脂结合磷酸肽后, 先用洗涤液(通常是乙酸溶液)去除未修饰肽段，接下来可用磷酸盐缓冲液或者高p H 溶液洗脱磷酸肽。洗脱
的磷酸肽可直接过R P 柱脱盐用于下一步质谱分析，也可离线进行进一步富集或其他操作。然而，I M A C 法确实存在一些复杂因素。如果携带多磷酸化位点的磷酸肽丰度较大，它们会覆盖 I M A C 树脂，导致单磷酸化或双磷酸化的磷脂肽保留较少。并且, 其他酸性肽段也会与 I M A C 柱发生亲和作用, 从而与鱗酸肽一起被富集。这一问题在应用于极度复杂的肽混合物(如全细胞提取物) 时会更加严重。为了避免该问题, 许多研究者试图通
过化学还原反应来甲基酯化酸性残基和C 端 (Ficarro et al. ，2 0 0 2 ) 。然而，研究发现甲基酯化反应并不是定量的（Cirulli et al. ，2 0 0 8 ) 。这样，目的肽段的存在形式将是修饰过、部分修饰或未修饰3 种。这增加了混合物的复杂程度, 给定肽段的相对量实际上减少了（Cirulli et al. ，2 0 0 8 ) 。

另外一种类似于IM A C法的方法，使用二氧化钛(TiO2)作为金属螯合树脂的替代物(Larsen et al.，2005; Pinkse et al. ，2004; Thingholm et al. ， 2006)。正如 IM A C法中修饰肽段的磷酸基团与H 价金属有亲和力一样，在酸性条件下磷酸基团同样与二氧化钛分子有亲和作用（Larsen et al.，2〇05; Pinkse et al. ，2004 ; Thingholm et al. ， 2006)。通过转换到高P H 缓冲液中，磷酸肽可以从 TiO2基质中洗脱下来。这种方法的优点在于，柱制备时间短，比 IM A X树脂洗涤循环数少。研究表明, 尽管这两种方法使用同样的亲和原理，但是它们却具有互补性—两种方法分别能够检测到不同磷酸肽（Cantiri et
al.，2007)。 IM A C 的特点是针对多磷酸化位点的肽段具备高亲和力，而二氧化钛则优先结合单憐酸化多肽 (Bodenmiller， e ta l. ，2007)。这表明在一个研究中同时使用两种方法能够最大限度覆盖憐酸化蛋白质组。

另外一类磷酸肽富集方法则利用化学方法在磷酸化位点引入亲和标签（Goshe etal.，2001; Oda e ta l. ， 2001)。该方法利用碱性环境，通过卩-消除反应从磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基中去除 H 3PO4 (McLachlin andChait，2003; Oda et al. ， 2001); 进而通过
Michael-like加成反应，将一个二巯基化物加到双键上 ; 接着用结合了生物素的烷化试剂处理巯基，得到的生物素化肽段可利用亲和素柱色谱来富集（图 40.1) (McLachlin andChait，2003)。这个方法的一个难点在于，由于生物素与亲和素间的高亲和力，回收标签化的肽段成为问题。并且，这个方法能够富集磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸，却无法富集磷酸酪氨酸。片消除反应后接 michael 加成反应同样会改变 O 联片 JV-乙酰葡糖胺（O-

G l c N A c )修饰，这样会与磷酸化竞争富集作用 (W e lls e t al. ，2002)。最后，在 , 消除反应的碱性环境下，会发生不需要的副反应，导致对肽段质量造成无法预料的影响，从而使下游的肽段质谱鉴定变得更加困难。

在质谱过程中，必须考虑磷蛋白的特定化学性质。发生在 S 或 T 氨基酸上的磷酸化是不稳定的。传统的断裂方法会导致磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸残基发生 H 3PO4 , 或HPO3选择性中性丢失，并且先于肽键的断裂绝大部分憐酸化修饰都发生了片消除反应，仅有一小部分憐酸化修饰伴随着肽链断裂而保留下来（Bennett et al. , 2002; L e e et al. ，2001; M a et al. ，2001)。这会造成质量谱图中包含的测序离子变少，而且通常这些离子强度会变弱。最终较低的信噪比（图 40. 2)会妨碍对肽段序列的解释。尽管磷酸酪氨酸也可能丢失磷酸基团，但是很少像磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基一样产生强烈的中性丢失离子。一些质谱仪使用 E T D 避免这种中性丢失问题，产生的谱图既适合于序列分析也适合于憐酸化残基测定。我们在介绍用于蛋白质组学鉴定P T M 的设备时，将会进一步讨论这种断裂方法。

另外，中性丢失伪迹(neutral loss artifact)也可为研究人员提供便利。中性丢失迹象是肽段中含有磷酸化位点的一个显著的指示信号。质谱中观察到的中性丢失峰通常由于其形成的优先性而具有高强度。因此，如果对于+ 1 价电荷肽段，发现前体离子丢失98 m /z(H3P4)或 80 m/z (H P0 3)，可以推断在肽段序列中存在一个磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基。现代质谱仪可以监测这种质量丢失。离子阱质谱仪能够分离中性丢失碎片，并开始另一轮断裂（MS3 scan) (Beausoleil et al. ，2004; Gruhler et al. ，2005; Olsen and Mann， 2004 ; Ulintzetal. ，2009)。这个附加分析步骤的结果就是提供了额外的序列覆盖范围，从而帮助鉴定磷酸肽，并将 P T M 匹配到特定氨基酸。另外一种 MS3¾ 描的替代方法就是运用于离子阱质谱仪的磷酸肽断裂「Pseudo MS」」或称多级活化（M SA)(SChro e d e re ta l. ，2004)。这种方法在 M S /M S扫描肽段产生的中性丢失产物引入了 C I D 。中性丢失离子产生的离子与初始MS/M S 产物离子一起被捕获得到复合谱。在 M S A 中，中性丢失离子被转变成一些结构上有益的碎片离子，这种离子在数据库搜索算法中的分数将会出现升高现象(Schroeder et al. ，2004; Ulintz et al. ，2009)。

磷酸化给肽段引入一个负电荷，这也将影响质谱的分析。当阳离子模式下操作时，这个负电荷会减弱质谱仪响应 (McLachlin and Chait，2001)，这会导致谱图质量变差，并使磷酸肽鉴定更加困难。而且，增加的负电荷会降低质谱分析前蛋白质混合物制备时的蛋白质水解作用。然而需要说明的一点是，Harnio Steen与同事发现 , 在使用电喷雾电离(electrospray ionization,ESI)选择性研究磷酸肽时 , 没有证据能证明电离程度 /探测效率会降低（Steen et al. ，2006)。

作为一种替代方法，Steve C a r r 和同事提出了前体离子扫描 (precursor ion scanning)技术，可以用来避免阳离子模式运行质谱时产生的一些问题 (Carr etal. ，1996)。串联质谱是在阴离子模式下运行，并且磷酸化残基会产生特征性的碎片 :P O 3— 大小为一 79 D a ，P O 2— 大小为一 63 D a 。当在前体离子扫描中发现以上事件中任何一个时，将会对前体离子进行 M S /M S 检测（Z a p p a c o s t a e t a L，2006)。这种方法检测磷酸肽时比阳离子模式质谱灵敏度更高 (Carret a L ，1M 6) 。然而，阴离子谱解释较为困难，因此并未得到广泛

2.2 糖基化

糖基化是一种常见的 P T M , 并且已经证明能够影响酶的活性、蛋白质定位、稳定性、信号转导、细胞黏附和蛋白质相互作用 (Spiro, 2002k 目前已经发现在肿瘤恶性转化和肿瘤发生时，生物体液中蛋白质和细胞表面的糖基化模式会发生变化 (Durand and Seta,2000)。一个蛋白质组中存在着大量糖基化修饰。O- 糖基化蛋白质是在丝氨酸和苏氨酸位点发生修饰 , 而 C -糖基化则靶向于色氨酸 ,N-糖基化靶向天冬酰胺。发生 N -糖基化的蛋白质会有一些共同之处，如核心结构、一些去除 N 联结构的酶，并且普遍分布在细胞膜胞外区域（Medzihradszky, 2005 ) 。 N-糖基化位点有一个确定的共有序列（consensussequence) ,即N-X-S/T ,X 是除脯氨酸之夕卜的任何氨基酸(Pless and Lennarz, 1977)。另— 个靶向丝氨酸和苏氨酸残基的修饰是 O联β-N-乙酰葡糖胺 (O G k N A c ) 。 Gerald Hart和同事开创了这种动态核质（nucleocytoplasmic) P T M 研究的先河（Holt and Hart,1986)。发生这种修饰的许多靶向蛋白质也能够发生磷酸化修饰，推测这种修饰对蛋白质磷酸化修饰会有拮抗作用 ( A h m a d et aL , 2006)。

质谱鉴定磷酸化的一些问题同样也出现在糖基化研究中。相对未被修饰的蛋白质，这些修饰在丰度上都倾向于亚化学计量。蛋白质糖基化和 O G l c N A c 修饰在质谱中都是不稳定的，通常产生低质量的测序谱图。尽管 N -糖基化的一种共有序列已经非常明确，然而在体内仅有部分含有这一共有序列的蛋白质发生了糖基化。

上面提到的可应用于磷酸化分析的替代的肽段断裂方法同样适用于糖基化。能够解决糖基化低丰度问题的富集技术也已存在 (Mechref e t a L ，2008)。使用凝集素亲和层析(lectin affinity chromatography) 可选择性地富集糖蛋白。凝集素是一种高度特异的糖结合蛋白，并能够与固相基质偶联 . 偶联好的树脂与复杂的水解蛋白质混合物混合，通过洗涤、洗脱即可分离到适用于蛋白质组学分析的糖肽组分。 O G l c N A c 可用 P-消除法及后续的 Michael加成二硫苏糖醇或生物素 -戊胺 (biotin pentylamine)反应来富集，这种方法类似于前文磷酸化中所详述的内容 (Wells et al. ，2002)。另一种方法是 N -联糖肽固相提取法（solid-phase extraction of N-Iinked glycopeptides，S P E G ), 这种方法使用肼化学法 (hydrazine chemistry)直接将糖肽添加到固相支架上 (Tian et al. ，2007)。洗漆后，用肽 -N -糖苷酶 (peptide-iV-glycosidase)处理来洗脱糖肽。凝集素亲和层析色谱法的优点在于，能够结合的糖蛋白范围非常广 , 通过不同糖苷酶洗脱能够有效分离不同类型的糖肽(Yang and H a n c o c k , 2005)。也有专门的柱子，所包含的凝集素特异地结合一定类型的糖连接结构，能提供更高不同程度的选择性富集（Tian et al. , 2007)。需要说明的是 , 使用糖苷酶诜脱糖肽是从肽段上切下寡糖，这使得原本可以通过质谱获得的结构信息丢失。但是这却大大简化了数据分析过程 , 因为糖基化的天然结构非常复杂，并且以多变的聚糖基化 (polyglycosylated)形式存在。

2.3 泛素化和苏素化修饰

泛素是一个由 7 6 个氨基酸组成的蛋白质，能够通过其 C 端的甘氨酸残基结合于底物赖氨酸的 α氨基基团。这个过程需要 E 1 、E 2 、E 3 酶共同参与（Fang and W e i s s m a n ,2004)。泛素的序列含有 7 个赖氨酸 , 这 7 个赖氨酸能够被泛素化选择，从而形成泛素链(Fang and W e i s s m a n ，2004)。被进一步泛素化的泛素分子内部的赖氨酸能够决定泛素化修饰的生物学意义。例如，K 4 8 连接的泛素链能引导被修饰蛋白质经由 26S 蛋白酶体降解 , 而 K 6 3 的连接形式则参与到 D N A 损伤反应、蛋白质运输、N F -KB 信号通路的信号转导等过程 (Ikeda and Dikic，2008; Pickart and F u s h m a n ，2004)。泛素化蛋白的周转非常迅速，这导致这种 P T M 处于低稳态水平 (Peng etal. ，2003)。而使泛素化位点的预测更加复杂化的是 , 几乎没有数据能够证明泛素化存在一个通用基序 (SUter etal. , 2008)。

另一个类似泛素的小蛋白质分子就是苏素化修饰蛋白（S U M O ) 。尽管两种蛋白质一致性仅 1 8 % , 但是它们的三维结构却有相似性 (Bayer et al. ，1998)。苏素化修饰和泛素化共享相同的 E 1 、E 2 、E 3 酶 , 将 S U M O 分子结合到一个保守基序内部的氨基酸残基上。苏素化修饰优先发生在女 K -X -E 序列中，^ 代表一个疏水性氨基酸（Rodriguez etal. ，2001)。苏素化修饰靶向于大量参与各种不同细胞进程的蛋白质 , 如转录调节、核小体形成、细胞核孔复合物和 D N A 修复 (Melchior et a L ，2003)。苏素化修饰能够与泛素化竞争，从而阻止蛋白质被降解 , 稳定细胞所需的关键的酶。这种修饰还能够将蛋白质进行特定的细胞定位 , 如核孔复合体 (M anza et al. ，2004)。

目前已经发展了一些有效的富集方法来分离泛素化和其他苏素化修饰的蛋白质。其中最成功的一种是在泛素及类泛素分子的基因序列中整合人氨基末端表位标签（aminoterminal epitope t a g K P e n g et al. ， 2003; Tagwerker et al. ， 2006)。目前已成功使用了多组氨酸标签，以及由多组氨酸标签和 F L A G 标签组成的串联亲和标签 (C h a n g , 2006)。串联亲和标签纯化方法能够减少假阳性的出现率，但是无法完全消除。使用抗泛素类分子的抗体是一种选择 , 但是这种抗体应用于免疫沉淀中以分离泛素蛋白质的方法仍在发展中。也可利用泛素结合蛋白质以避免一些由抗体和亲和标签引起的问题 (Kirkpatricketal. ，2005)。表位标签在简单模式系统，如酿酒酵母 (Sacc/iarom^ ycescereTO’ h a e ) 中应用非常方便，因为编码未标签泛素的多个基因可被删除，使得细胞中仅有含表位标签的泛素分子。

事实上，泛素化和苏素化修饰都是蛋白质类 P T M , 可采用多种质谱的手段鉴定靶蛋白。当胰酶消化泛素化蛋白质时，部分泛素分子被切割下来。剩下胰蛋白酶消化片段的泛素化位点上含有 2 个甘氨酸残基，通过一个异肽键与赖氨酸相连（P eng et a L ，2003)。这一肽段导致在赖氨酸残基处产生了一个 114 D a 的标称质量漂移，而且由于胰蛋白酶不能识别修饰过的赖氨酸，因而还丢失了一个胰蛋白酶酶切位点。对于其他苏素化修饰也有各自特征性的质量漂移 , 见表 40. 2(D enis〇n et al. ， 2005)。当搜索谱图寻找该类型的潜在 P T M 时，可以考虑这些特性。

使用基于质谱的蛋白质组学方法研究此类 P T M 的一个显而易见的问题就是质量 S移 (mass shift) 的冗余，如表 40. 2 所示。从一个肽的鉴定谱图中可能无法分辨这是泛素化修饰还是苏素化修饰，因为这两种类型都能在赖氨酸残基处增加 114 D a 。苏素化修饰会使肽段质量增加较大，这会影响肽段的电离，减弱电离效率。发生苏素化修饰肽段会使结果谱图变复杂，甚至无法解读。一个实验室发展了苏素化修饰模式识别软件（S U M -m 〇n ) ，来寻找由复杂 P T M 产生的碎片离子模式，并鉴定修饰肽段及其相应的修饰位点