翻译后修饰蛋白质的定性和定量实验（四）
三、蛋白质的硝化修饰
酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸侧链的硝化与亚硝化作用构成了蛋白质硝化PT M 的主要部分。这些加成反应由发育、氧化应激及衰老过程中产生的活性氮介导。活性氮的增加是由一氧化氮和活性氧的过度反应或调控紊乱造成的（Yeo et al.，2008)。活性氮和活性氧能够靶向于DNA、脂类和蛋白质 (Barnes e ta l.，2003)。根据产生的自由基，活性氮将会优先与酪氨酸残基反应，形成3-硝基酪氨酸或3-亚硝基酪氨酸(Beckman et al.， 19如\ 酪氨酸的硝化修饰的特性也许可通过产生的加合物得到最好的描
述。研究表明，酪氨酸硝化水平的增加与衰老相关的神经退行性疾病有关 ，而且可以作为氧化应激的一个生物标志物(Yeo et al.， 2008)。 在正常生理条件下，硝化酪氨酸加合物的形成会被存在的还原剂, 如谷胱甘肽阻止(C henet al., 2004)。 酪氨酸硝化会将结合的羟基的 PKa 从 10.1改 变 至 7. 2, 并导致被修饰蛋白质结构和功能上的改变(Sokolovsky et al., 1967)
目前没有能够直接分离硝化多肽和蛋白质的选择性富集策略。这 可 能是由于这种PT M 的一氧化氮基团的化学活性较低。在有连二亚硫酸钠（dithionite，DTH)存在的还原环境中，这些相对惰性的部分可被转换成胺类, 从而易于与标签基团反应（Yeo et al.，2008)。随 后 ，标签化的多肽可通过蛋白质组学方法选择性分离和分析。 目前应用最普遍的鉴定蛋白质硝化修饰的方法，是将2I > G E 与某一给定的硝化加合物的特异性抗体的免疫印迹分析结合 (Zhan and Desiderio, 2004)。 蛋白质通过2D —— G E 实验被 解 析 ，并通过适当抗体直观的观察到发生此种修饰的蛋白质。进而将免疫印迹阳性的斑点从胶上切 离 ，消化后利用质谱进行鉴定 (Zhan and Desiderio, 2004) 。 对于酪氨酸硝化修饰，在搜索质谱数据鉴定加合位点时，可根据加合物的不同进行鉴别: 硝化作用产生一个 45 D a 的标称质量漂移，而亚硝化作用产生一个 29 D a 的标称质量漂移。
四、甲基化和 乙 酰 化
赖 氨 酸 和 精 氨 酸 的 甲 基 化 修 饰（+ 14 D a ) 以 及 赖 氨 酸 乙 酰 化 修 饰（+ 4 2 D a ) 这 两 种P T M 类 型 在 组 蛋 白（histone) 密 码 中 的 作 用 正 在 被详 加 分 析 (Jenuwein and Allis, 2001;Strahl and A U i s ，2000)。第 一 次 发 现 与 赖 氨 酸 连 接 的 乙 酰 基 是 在 一 项 对 组 蛋 白 修 饰 的研 究 中 (Jenuwein andAIlis，2001)。组 蛋 白 乙 酰 化 水 平 增 高 通 常 与 基 因 转 录 的 局 部 激 活有 关 (Zhang et al. ，2002)。而 组 蛋 白 赖 氨 酸 甲 基 化 则 集 中 于 被 抑 制 基 因 的 启 动 子 区 域(Berger，2007)。研 究 发 现 ，乙 酰 化 是 动 态 可 逆 的 ，而 甲 基 化 更 稳 定 而 且 「长 寿 」（Bernstein and Allis， 2005)。 尽 管 大 量 研 究 都 集 中 在 这 些 组 蛋 白 上 的 P T M ，但 甲 基 化 和 乙 酰化 修 饰 在 许 多 蛋 白 质 上 都 会 发 生（Glozak et a L ，2005; Grewal and Rice，2004; Sadoul
e t a L , 2008; Y a n g and Seto, 2008)。在 真 核 生 物 中 ，N 端 乙 酰 化 是 最 常 见 的 P T M 之一 ，大 约 8 5 % 真 核 蛋 白 都 会 发 生（Polevoda and S h e r m a n , 2000)。第 一 个 发 现 的 被 乙 酰化 和 去 乙 酰 化 调 节 的 非 组 蛋 白 是 p5 3 蛋 白（G u and Roeder, 1997)。
与 许 多 其 他 P T M — 样 ，传 统 的 鉴 定 甲 基 化 和 乙 酰 化 的 方 法 是 利 用 能 识 别 修 饰 的 特异 性 抗 体 (antibody)。但 是 这 个 方 法 受 限 于 免 疫 方 法 相 关 的 交 叉 反 应 以 及 特 异 性 问 题 。关 于 组 蛋 白 ，有 一 些 从 细 胞 核 中 选 择 性 分 离 的 方 法 (Garcia et al. ， 2007)。 更 通 用 的 鉴 定甲 基 化 和 乙 酰 化 位 点 的 方 法 是 利 用 体 外 放 射 性 标 记 分 析 。这 一 技 术 利 用 了 乙 酰 基 转 移 酶或 甲 基 转 移 酶 来 催 化 加 成 放 射 性 乙 酰 基 或 甲 基 供 体 。薄 层 色 谱 法 (T L C )或 H P L C 分离之 后 进 行 微 量 测 序 ，能 够 揭 示 放 射 性 标 记 氨 基 酸 (Sobel et al. , 1994)。这 种 放 射 性 标 记方 法 有 它 的 缺 陷 ，它 需 要 的 纯 的 起 始 材 料 量 非 常 高 ，并 需 要 使 用 放 射 性 检 测 修 饰 氨基 酸 。
目 前 没 有 一 种 有 效 的 方 法 能 够 选 择 性 富 集 甲 基 化 或 乙 酰 化 修 饰 的 肽 段 或 蛋 白 质 。另外 ，由 于 甲 基 化 和 乙 酰 化 发 生 在 碱 性 残 基 上 ，在 利 用 胰 酶 作 为 蛋 白 酶 时 进 行 酶 切 的 效 率 较低 。尤 其 对 于 甲 基 化 修 饰 这 一 问 题 更 为 严 重 ，因 为 碱 性 残 基 可 能 在 多 个 胺 位 点 发 生 甲 基化 。要 克 服 这 个 问 题 比 较 简 单 的 选 择 就 是 使 用 另 外 的 蛋 白 酶 。然 而 ，丢 失 的 胰 蛋 白 酶 切位 点 也 可 能 给 研 究 者 提 供 了 帮 助 ，它 可 以 作 为 一 个 指 示 以 说 明 该 位 点 可 能 发 生 了 修 饰 。串 联 质 谱 搜 索 算 法 能 够 考 虑 到 乙 酰 化 和 甲 基 化 修 饰 分 别 带 来 的 42 D a 和 14 D a 的平 均 质量 漂 移 和 28 D a 双 甲 基 化 质 量 漂 移 以 及 42 D a 的 三 甲 基 化 质 量 漂 移 。 由 于 三 甲 基 化 和 乙酰 化 肽 之 间 的 质 量 漂 移 仅 相 差 0.0363 D a ，因 此 在 研 究 三 甲 基 化 时 可 能 发 生 错 读 。利用 一 个 质 量 精 确 度 和 分 辨 率 足 够 高 的 质 谱 仪 可 以 分 辨 这 一 质 量 差 异（Zhang et al. ,2 0 0 4 ) 。
另 一 个 鉴 定 乙 酰 化 和 甲 基 化 的 诊 断 工 具 是 分 析 C I D 类 型 质 谱 中 产 生 的 亚 胺（i m m o -n i u m ) 离 子 。含 有 未 修 饰 赖 氨 酸 的 肽 段 通 常 在 8 ½ ¾ ‘ 处 产 生 一 个 特 征 性 的 亚 胺 离 子 峰(Trelle and Jensen, 2007)。当 赖 氨 酸 发 生 修 饰 时 , 会 形 成 一 个 不 同 的 具 有 独 特 W z 值亚胺 离 子（图 40. 3 ) 。受 限 于 发 生 的 重 排 反 应（rearrangement reaction), 无 法 形 成 双 甲 基 或三 甲 基 化 形 式 的 亚 胺 。然 而 ，三 甲 基 形 式 会 产 生 一 个 独 特 的 中 性 丢 失 碎 片 ，与 前 体 相 比 少了 59 D a , 这 是 由 于 丢 失 了 一 个 三 甲 胺 (Zhang et al. ，2004)。图 40. 3 展 示 了 发 生 的 重 排反 应 ，以 及 不 同 亚 胺 离 子 及 其 相 应 的 值 。这些独特 的 鉴 别 特 征 仅 能 通 过 C I D 质产获得。
五、质 谱 分 析
质谱仪器的多种设计和配置都支持蛋白质组的动态性质及其相关 P T M 的研究工作 。对 鉴 定 PTM 而言，质谱仪的最重要的两个特征（feature) 就是其质量准确度和分辨率 。与蛋白质鉴定不同 (其通常是基于鉴定同一蛋白质中的多个独立肽段)P T M 必须通过单独的 MS/M S 谱图来鉴定。 J ohn Y ates 及其研究团队发展了一些方法，利用不同酶独立消化产生的重叠肽段增加序列覆盖度，以减少绘制修饰图谱时的不确定性 (MacCosset al., 2002; W u et al.， 2003)。尽管大量重复的肽段序列减少了不确定性, 但是这一方法仍需要足够的起始材料以用于多次质谱分析。
由 于 P T M 的鉴定及其在肽段上的定位通常依赖于单一的 M S /M S 谱 ，因此具备高质量准确度和分辨率的质谱仪有着明显的优势 (Clauser etal. ， 1999; H a a s e t a L , 2006;M a n n a n d K e l l e h e r , 2008)。质谱设备因肽段电离、肽段断裂、离子分离和信号检测方法的不同而异。基于质谱的分析方法也通常与色谱分离技术联用以提高灵敏度，可帮助给定生物样品中的多肽检测及分离复杂的肽段混合物。正如前文所强调的，许多色谱法都可以富集目的P T M ，从而提供了一种更有效的方法来鉴定复杂蛋白质或肽段混合物中的修饰作用。很明显，设备配置和分离技术的结合为研究者带来了令人眼花缭乱的可能性。本部分中, 我们尝试讨论目前所用质谱的优点和可能的局限。
可能目前蛋白质组学中应用最普遍的质谱仪都采用电喷雾电离 (E S I ) 将肽段引入气相 ，进而通过下游设备进行分析。这种类型的设备包括离子阱、三重四极杆、飞行时间(T O F )、四极杆飞行时间 (q-T O F )、轨道阱 (M a k a r o v ， 2000) 和傅里叶变换离子回旋共振(F T -I C R ) 等。离子讲设备的优势在于快速扫描时间和高灵敏度，然而它们受限于质量精确度（士 0. 1〜 I D a ) 和分辨率。在离子讲质谱 (ion trap m a s s spectrometer)中，C I D 的机制不支持捕获质量小于前体质量 2 8 % 的碎片。造成的直接后果就是丢失了 1/3 的 M S /M S 数据。这种局限性被称为 C I D 碎片的「1/3 法则」或「低质量截除」(cut-〇 ff)。其他质谱 仪 ，如 q-T O F 、三重四极杆、轨道阱及傅里叶变换设备则保留了低质量生成离子。低质量生成离子可能提示一些有关肽段的序列组成信息，这对从数据库中搜索到确定的P T M非常有用。
为解决有限的准确度和分辨率问题，可以将线性离子阱与轨道阱分析器结合起来，组成 混 合 L T Q -轨道阱质谱。质量准确度可以提高至低 p p m 级 ( < 5 p p m ), 并且增加的分辨率能够分辨肽段的同位素包络(isotopic envelope) , 因此可以确定前体肽的荷电状态。q-T O F 是研究 P T M 的非常好的选择，因为它们使用的断裂方法利于保持不稳定的肽段修饰。这要归功于其高能量断裂方法，以及断裂发生的时间范围非常短。 T O F 质量分析器对于分析前体和碎片离子都具有高质量准确度和分辨率。对于串联质谱实验，T O F 质谱分析器可以通过碰撞室分隔开(T O F -T O H 产 生 常 规 的 M S /M S 谱 (Medzihradszky et a L ，2000; Vestal and C a m p b e l l, 2005)。 目前在可利用的质谱仪中，F T -I C R 设备具备最高的准确度和分辨率。然而其高昂的价格对许多实验室来说是难以承受。除此之外，其低扫描率降低了设备的灵敏度，为获得一个可测的信号必须使用大量分析物。
一般来说，E S I 是最适合鉴定酸性小肽的(Covey et al., 1991)。 E S I 通常产生+ 2 价或+ 3 价电荷状态的胰蛋白酶消化的肽段，而 M A L D I 技术通常产生一个+ 1 价电荷状态的离子。这种复杂性使得质谱图的解释变得更加困难，除非该设备在分辨肽段同位素簇和确定前体离子、碎片离子及电荷状态时具备高分辨率和质量准确度。通常会将这些设备与低流速色谱在线分离相结合，以获得较高灵敏度，并且能够快速从复杂蛋白质水解物中鉴定出肽段。但是这种在线方法的一个非常大的限制是，只有当肽段正在从色谱柱中洗脱下来时才能得到这一肽段的谱图。也就是说，一旦样品洗脱后进人设备，就不能对肽段进行重复分析，这导致数据获取的时间限制。更糟糕的是, 同时洗脱的肽段会抑制相关肽段的电离。除此之外, 未修饰肽段及其发生翻译后修饰的肽段通常有着相近的洗脱时间 ，这导致修饰肤段的信号减弱。
E S I的一种替代方法是基质辅助激光解吸附电离（matrix assisted Iaser desorption ionization， MALDI)。 MALDI设备通常使用T O F 分析器，但是也可使用其他质量分析仪 。这种电离方法使用激光照射样品，样品由分析物(肽段) 和紫外线吸收基质组成。基质通常是芳香族酸性组分，能够从激光中吸收能量。基质吸收的能量中一部分转移到分析物中，并 共 同 解 吸 附 到 气 相 ，气 相 中 分 析 物 被 电 离 并 进 人 到 下 游 质 谱 仪 进 行 分 析 。M ALDI既可用于肽段也可应用于整体蛋白质。当应用于后者时, 未水解蛋白质上的P T M 能够被鉴定。然而，这个方法需要事先了解一些修饰信息，来解释修饰造成的相对未修饰组分的质量漂移。此外 , 除 了 比 E S I适合分析较大的分析物外,MALDI也利于略
偏碱性肽段的分析(Covey et al. , 1991)。
与 E S I 在线色谱分离不同，M A L D I 分析的肽段通常是离线分离。样品可以通过液相色谱法分离，然后点到 M A L D I jP, 盘（M A L D I target plate) 中（Lochnit and G e y e r ，2004 ; Pflieger et al. ，2008; Z h e n et al. ，2004)。 目前有不同的方法可以用来点靶，其中可使用专门设计的自动化机器人。基质材料既可以与样品混合然后点靶, 或者在点样品之前或之后直接将基质点到靶盘中。点的大小根据所使用靶盘的规格不同而异， 一 般从微升到亚微升不等。这个方法的离线特性去除了在线色谱分离的时间限制。这意味着研究者可以利用M A L D I 盘中的样品完成对同一个靶点的重复测量，直到样品被设备激光耗尽。
M A L D I -T 0 F 设备的快速性以及主要产生+ 1 价离子的性质使得该设备成为快速测量肽段和蛋白质质量的便利选择。一个水解的蛋白质样品可以点到M A L D I 盘中 ，无需过多处理，短时间内就可得到相关肽段质量谱图。研究者可能从前期研究中了解到样品中存在什么蛋白质，因此对相应的m 夂值也会有预期。这些已知的值可以与实验检测到的数值进行比较，得到的任何差异都可以归因于蛋白质上发生的修饰。这个方法简单、快速 ，并独立于序列算法。对于可疑的磷蛋白，可用碱性磷酸酶处理样品，并 与 M A L D I -T O F 联用鉴定磷酸肽(Larsen et al. ， 2001; Z h a n g et al. ， 1998)。磷酸酶处理前后肽图中的差异(80 D a )可以帮助鉴定憐酸肽。定位到特定修饰氨基酸通常需要对修饰肽进行串联质谱分析，这时要使用支持M S /M S 的 仪 器（如离子阱、q-TOF 、T 0 F /T 0 F )。
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