ACE HILIC色谱柱方法开发指南Ⅵ - HILIC应用实例（一）
ACE HILIC法开发平台和工作实例图17显示了HILIC方法开发的流程图。
一般方法是：收集分析物相关的信息（如果已知的话），针对三个ACE HILIC相（用三款不同的ACE HILIC色谱柱在不同的pH洗脱液条件下）执行梯度或等度HILIC筛选实验（取决于样本分析物的亲水性范围），然后再优化色谱法以达到可接受的HILIC法。
表1中列出了ACE HILIC筛选条件。
这些设计旨在探索广泛的选择性范围，以及为达到所需分离提供一个良好的起点。
图17
ACE HILIC 方法开发流程图
表1
ACE HILIC筛选实验的条件
| 参数 备注 | |
| 色谱柱 | ACE HILIC-A, ACE HILIC-B and ACE HILIC-N, 150 x 4.6 mm, 5 µm |
| 梯度流动相 | A：10 mM甲酸铵（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v） B：10 mM甲酸铵（溶于MeCN/H2O中）（50:50 v/v）甲酸铵的pH值为：3.0、4.7或6.0. |
| 梯度筛选 |
时间 %B |
| 0 | 0 |
| 15 | 100 |
| 20 | 100 |
| 21 | 0 |
| 41 | 0 |
| 等度流动相 | 10 mM甲酸铵（溶于MeCN/H2O中）（90:10 v/v）甲酸铵的pH值为：3.0、4.7或6.0. |
| 流速 | 1.5 mL/min |
| 温度 | 25 °C |
| 检测 | 取决于样本（视样品而定） |
ACE HILIC色谱柱保存方法
使用之后，ACE HILIC色谱柱应使用体积比为7:3的乙腈和水进行冲洗，清除掉所有的缓冲盐。
然后，使用100%的异丙醇、以更低的流速进行冲洗，以便贮存。应往回拧紧色谱柱端盖（拧紧色谱柱端盖），并将色谱柱放回盒内。
每次分析运行之后，除非第二天要使用，否则建议采用密闭法（按长期保存的方法）清洗色谱柱，然后用异丙醇冲洗。
实例1 – 咖啡因和相关化合物
方法开发中所需的咖啡因和四种相关化合物（可可碱、茶碱、次黄嘌呤和黄嘌呤）这些化合物都是极性的中性物质，其中负log P值表示合理的亲水性（log P为负值明确的表明其亲水性），因此适用于HILIC（图18）。
图18
咖啡因和相关物质的结构和log P数据
咖啡因和相关化合物在pH为3-6的情况下不可电离，因此洗脱剂的pH几乎不会直接影响分子。
为此，选择pH 3.0和4.7。
固定相会受洗脱剂pH变化的影响，这可能是有利的一面。
固定相的电离变化将影响粒子周围的水合层，这会影响分析物分散到相中（分配在固定相上）或形成氢键的程度。
因此，在pH3.0和pH4.7的情况下对三个固定相进行筛选，结果如图19中所示。
新的ACE HILIC色谱柱使用60倍柱体积相互平衡（平衡），以在粒子周围形成水合层。表1中显示了流动相、梯度和温度。
筛选结果显示：三个固定相与两个pH值之间观察到一些选择性差异（三个固定相在两个pH值下的筛选结果可以看出彼此间具有选择性的差异）。
基于筛选数据的最有效分离是针对pH为3.0下的（pH为3.0下的）ACE HILIC-N相。
这些数据选择（选定这些条件）用于进一步优化。
图19
ACE HILIC色谱柱的梯度筛选
条件如表1中所述，275nm条件下的检测除外。进样25mg/mL的咖啡因混合物2μL（使用pH3.0和pH4.7的甲酸铵，以0.5%w/w的比例混合相关物质和MeCN/H2O（90:10 v/v））
样本：
1) 咖啡因
2) 茶碱
3) 可可碱
4) 黄嘌呤
5) 次黄嘌呤
