采用CORTECS UPLC HILIC色谱柱开发ACh、HA及其代谢产物...（一）
采用CORTECS UPLC HILIC色谱柱开发ACh、HA及其代谢产物的UPLC/MS/MS定量测定法
应用优势
■ CORTECS™UPLC® HILIC色谱柱的分离度可实现对ACh、HA及其代谢产物的同时定量
■ 总运行时间仅2.5min，符合高通量筛查需求
■ 96孔板的应用简化了样品制备(小于15min)
■ 较之先前的报道方法，高灵敏度的Xevo® TQ-SMS允许所用样品体积更小，稀释倍数更高
沃特世解决方案
ACQUITY UPLC®系统
Xevo TQ-S质谱仪
CORTECS UPLC HILIC色谱柱
ACQUITY®收集板
关键词
生物分析，生物标记物，脑脊液，定量，神经递质，乙酰胆碱，胆碱，组胺，t-甲基组胺，t-甲基咪唑醋酸，UPLC，HILIC，CORTECS
简介
在药物研发中，来自体液的生化标记物常被用作诊断疾病和评估药物疗效的有效方式。乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)和组胺(Histamine,HA)是强极性神经递质，存在于几乎所有哺乳动物组织中。它们在睡眠调节、记忆、学习和免疫反应中发挥着一定作用1-3。大脑中ACh水平下降会导致记忆功能障碍，尤其是阿尔茨海默氏症患者的ACh供应明显不足1。因此，在这类认知障碍的治疗中对于如何促进ACh的释放进行了广泛的研究。
组胺由组氨酸的脱羧作用生成。组胺或是被储存起来，或是被其主要的降解酶组胺-N-甲基转移酶或二胺氧化酶迅速灭活并代谢为两种主要代谢产物t-甲基组胺(t-mHA)和τ-甲基咪唑醋酸(t-MIAA)。脑内组胺参与广泛的生理功能，例如睡眠-觉醒周期调节、唤醒、食欲控制、认知、学习和记忆2,3。据了解，在精神分裂症患者脑脊液中组胺的代谢产物增多4,5。因此，脑脊液(CSF)中HA、t-mHA和t-MIAA的浓度可以作为脑组胺活性的指标。鉴于ACh、HA及其各自的代谢产物具有重要的生理学作用，其生理浓度变化的测量可作为疾病进展或药物治疗的评估指标，这一功能使得这类物质成为药物研发中非常重要的生化标记物。
开发ACh、HA及其代谢产物的靶向分析方法是人们一直以来面临的挑战，因为它不仅需要具备高灵敏度和高选择性，还需要具有较快的样品分析速度。此外，ACh、HA及其各自代谢产物之间的内源性循环浓度存在极大差异，使得同时测定这些物质需要较宽的定量动态范围。虽然目前有多种用于定量这类分析物分析方法(GC/MS，HPLC-EC和LC/MS)6-8，但很少有方法能够同时测定啮齿动物脑微透析液或CSF基质中的ACh、HA及其各自代谢产物9。在含较高水相的洗脱条件下，分析物与基质抑制组分可能会共流出并且MS电离能力较差，使得反相(RP)液相色谱法结合MS检测的方法因灵敏度较低而受到限制10。亲水作用液相色谱(HILIC)能够提高极性物质的色谱保留性能，可与反相色谱进行正交实验用于极性和可电离化合物的分离，并能改善质谱响应，正日益成为应对这些极性分析物分离挑战的不二之选。
本文中介绍的方法展示了在96孔板中同时定量人CSF中的ACh、HA及其各自代谢产物。利用一步法样品制备技术制备样品，取20µL样品进行稀释，再执行HILICUPLC/MS/MS分析。采用亚2µm颗粒的高效CORTECS UPLC HILIC色谱柱能够实现分析物与内源性基质的分离，提高分析灵敏度，分析时间只需2.5min，因此本方法快速、灵敏、准确且选择性好，符合药物开发的高通量生物分析需求。
实验
样品制备
20µL人工脑脊液(aCSF)标准品、aCSF质量控制(QC)样品或人脑脊液(含4mM毒扁豆碱)将QC样品转移至1mL的96孔板中。向样品中加入含有浓度分别为1ng/mL的d4-乙酰胆碱、d4-组胺、d3-t-甲基组胺和d3-t-甲基咪唑醋酸(用作内标(ISTD))的乙腈100µL。盖上96孔板，并进行涡旋混合。然后，将样品在4000rpm下离心5min，取10µL样品进行UPLC/MS/MS分析。
UPLC条件
系统： ACQUITY UPLC
色谱柱：CORTECS UPLC HILIC1.6µm，2.1mmX100mm(部件号186007106)
流动相A：100mM甲酸铵，pH3
流动相B： 乙腈
梯度：初始为90%的流动相B，在0.75min内线性增加至60%，保持0.25min，然后在0.25min内线性减少至30%，并保持0.65min。最后在1.9min内返回至初始条件。
流速： 0.5mL/min
柱温： 45℃
样品温度：6℃
进样体积：10µL
运行时间：2.5min
收集板： Waters® ACQUITY1mL收集板
MS条件
质谱仪：Xevo TQ-S
电离模式：ESI+
毛细管电压：3.0kV
脱溶剂气温度：550℃
锥孔气体流速：150L/h
脱溶剂气流速：900L/h
碰撞室压力：3.58X10 (-3)mbar
碰撞能量： 按组分优化，见表1
锥孔电压： 按组分优化，见表1
数据管理
色谱分析：MassLynx®软件
定量： TargetLynx™软件
结果与讨论
质谱分析
利用沃特世Xevo
TQ-S质谱仪在ESI-MS/MS正离子模式下对ACh、HA及其各自代谢产物进行检测和定量。使用MassLynxIntelliStart™软件自动优化针对ACh、HA及其各自代谢产物和相应的氘代稳定同位素标记形式(作为内标)所选择的多重反应监测(MRM)通道，如表1所示。每个MRM通道驻留时间短至25ms，以及MS系统的快速扫描时间，使其能够同时采集所有化合物峰并达到每峰数据点>/=10。
