ACE HILIC色谱柱方法开发指南Ⅵ - HILIC应用实例（二）
较早洗脱峰的保留窗口（时间段）非常窄，这表示：等度HILIC可用于分离分析物。（等度方式的HILIC可以被用于分离这些化合物）10mM甲酸铵，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）被选为等度条件（图20）。
在这些条件下，峰4和5要保留得更多（好），但峰2和3仍未解析出（被分离）。
根据梯度运行的结果，乙腈含量更高似乎不会提高峰2和3的解析度（高的乙腈含量没有提高2与3峰的分离度），所以梯度HILIC分析得到改善（所以梯度分析是对混合物分离有更合适的，温度将被研究），从而开发出最终方法，如图21所示。
ACE HILIC-N相中咖啡因和相关化合物的等度分析
ACE HILIC-N相中咖啡因和相关化合物的等度分析
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，
150 x 4.6 mm
流动相：10 mM甲酸铵，pH3.0（溶于MeCN/H2O中）（94:6 v/v）
流速：1.5 mL/min
温度：25 °C
检测：UV, 275 nm
进样：2 μL
样本：
1) 咖啡因
2) 茶碱
3) 可可碱
4) 黄嘌呤
5) 次黄嘌呤
温度的降低会提高茶碱与可可碱之间的解析度（分离度），因此，最终方法（图21）被认为适合其用途。
图21
最终开发方法：
色谱柱：ACE 5 HILIC-N，150 x 4.6 mm
流动相：A = 10mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O中（96:4 v/v）中 B = 10mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O（1:1 v/v）中
梯度：0-100%B在15分钟内，100%B持续5分钟，下一次进样维持在起始条件20分钟
流速：1.5 mL/min
温度：15 °C
检测：275 nm
进样：2 μL
实例2 – 肌酸和肌酐
肌酸（图22）是使用甘氨酸和精氨酸合成的氨基酸。
它在为体内细胞提供能量方面起着重要作用（在体内主要用于为细胞供能），并形成（生成）副产品肌酐。测定血液中的肌酐，确定肾功能是否正常，其中肌酐水平的增加表示肾可能不会完全过滤废物。（升高表明肾的过滤废物的功能有所降低）
图22
结构和log P肌酸和肌酐数据
图23
使用pH为3.0、4.7和6.0的甲酸铵对ACE HILIC范围的等度筛选对比
样本：
1) 肌酐
2) 肌酸
在三种pH值条件下，利用等度条件对三个HILIC固定相的两种分析物进行筛选。
结果表明：肌酐在三个ACE HILIC相中被适当地保留，但由于过度保留的原因，肌酸在合理的时间内没有洗脱。
根据图17中的流程图，过度保留窗口表示梯度（宽时间段表明梯度方法）可能更适宜。
图24
ACE HILIC-A相下的最终方法
ACE HILIC-A在pH3.0下选择，进行梯度分析。
标准梯度在10分钟内析出两种目标分析物，并且解析度很高（分离度很高）（数据未显示）。因此，这使得梯度时间进一步减少（这种情况下可以使梯度运行时间进一步减少），从而缩短了整体运行时间。
最终方法如图24中所示。
色谱柱：150 x 4.6 mm, 5 μm
流动相：
A：2 mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O（90:10 v/v）中
B: 2 mM甲酸铵（pH3.0）溶于MeCN/H2O（50:50 v/v）中
梯度：5-55%B，在10分钟内
流速：1.5 mL/min
检测：230 nm
进样：5 μL
样本：
1) 肌酐
2) 肌酸
结论
HILIC是一种用于多用途的极性分析物色谱分析法（对于极性化合物来说是一种通用的色谱分析模式）。
这种方法比较复杂，但如果遵循简单规则，则可实现可再现的HILIC方法（HILIC方法是可以重现性的）。
三个ACE HILIC相（固定相）设计用于HILIC方法开发期间研究选择性，并尽可能快地提供实现所需分离的选项。
ACE HILIC方法验证协议（规程）已成功用于开发一系列的HILIC方法，应为HILIC方法开发活动提供一种结构化的方法。
