Cell Reports | 一种更精确高效检测R-loop的方法
R-loop是生物体在转录过程中形成的特殊的三链核酸结构，转录过程中新合成的RNA链与模板DNA链互补配对，形成的DNA:RNA杂合双链与非模板DNA链一起被称为R-loop【1】。R-loop在生物体内普遍存在，并参与了许多生物学过程，例如转录过程、DNA复制、基因组不稳定性以及染色体重排等【2-4】。
R-loop的异常导致多种人类疾病的发生，包括很多神经以及神经退行性疾病【4,5】和癌症的形成【6】。因此，对R-loop的形成以及功能方面的研究有助于于我们对疾病的认识。检测R-loop在基因组中的定位是研究R-loop功能首先要解决的问题。
目前，主要有两种检测R-loop基因组定位的方法。第一种方法依赖于S9.6抗体，S9.6能够识别DNA:RNA杂合双链，这类方法包括DNA:RNA immunoprecipitation (DRIP)，以及基于DRIP的改进的方法：bis-DRIP，S1-DRIP和RDIP【7-10】。这类方法应用比较广泛，但实验操作比较剧烈，会损伤一些相对弱的R-loop，并且研究发现S9.6能够结合双链RNA。另外一种方法是依赖于RNaseH，RNaseH能够识别DNA:RNA杂合双链。这类方法包括DNA:RNA in vitro enrichment (DRIVE)【8】和R-loop chromatin immunoprecipitation (R-ChIP)【11】。R-ChIP需要首先获得稳定表达RNaseH的细胞系，这在很多疾病细胞中并不容易获得，因此解决这些问题并开发精确高效的R-loop检测方法非常重要。
近日，美国宾夕法尼亚大学Kavitha Sarma和Roberto Bonasio团队（共同一作为Qingqing Yang和Emily Shields）在Cell Reports上发表文章Mapping Native R-Loops Genome-wide Using a Targeted Nuclease Approach，开发了一种高效检测R-loop的方法——MapR。
Mapping R-loops (MapR)是一种依赖于RNaseH，并结合CUT&RUN【12,13】技术来检测基因组中R-loop的方法。在MapR中，失去了催化功能的RNaseH能够结合R-loop，进而利用融合蛋白中的微球菌核酸酶MNase对核酸链进行切割，释放包含有R-loop结构的核酸序列。MapR过程如下图所示，首先将细胞结合到concanavalin A beads上(step1)；然后加入失去催化活性的RNaseH 与MNase的结合蛋白(RH∆-MNase)，钙离子缺失时，MNase不会发生催化反应(step2)；加入钙离子，激活MNase活性， MNase会在RH∆结合位点两端对核酸进行切割，30分钟后加入EGTA和EDTA终止反应(step3)；核酸片段从细胞核内释放并回收纯化(step4，step5)，进行高通量测序。
相对于其它检测R-loop的方法，MapR具有以下几个特点：1）MapR的整个实验过程是在细胞内，并且利用MNase对核酸序列进行切割，能够检测到一些相对弱的或是瞬时形成的R-loop；2）MapR不依赖S9.6抗体，不需要构建稳定表达RNaseH的细胞系，整个实验过程只需要一天时间，并且适用于不同的细胞类型；3）MapR技术也可以在少量细胞有效的检测到R-loop，因此可以用来检测人类某些疾病细胞中R-loop的变化。
目前MapR的方法是利用双链DNA建库测序，不能明确的区分DNA:RNA杂合双链中的DNA是正链或负链，在以后的研究中将会通过单链DNA或者RNA建库解决链特异性问题。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.09.052
参考文献
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