药物检测案例--水杨酸类药物及其制剂的质量检测
氟尼药典收载的水杨酸类药物有水杨酸、水杨酸二乙胺、水杨酸镁、阿司四林、对氨基水杨酸钠、贝诺酯、二氟尼柳和双水杨酯等。
一、性状
阿司匹林、对氨基水杨酸钠、贝诺酯和二氟尼柳的性状描述见表1。
二、鉴别
(一)化学法
1.三氯化铁反应此反应为酚羟基的反应,结构中含有酚羟基的药物可利用本反应进行鉴别。
水杨酸类药物在中性或弱酸性条件下,与三氯化铁试液反应,生成紫色配合物。
此反应适宜的pH为4～6,在强酸性溶液中配位化合物分解。本反应极为灵敏,只需要取稀溶液进行试验;若取样量大产生颜色过深时,可加水稀释后观察。
对氨基水杨酸钠加稀盐酸呈酸性后,可与铁离子形成紫红色的配位化合物。贝诺酯需加氢氧化钠试液煮沸,使酯水解,滤过,液加盐酸适量至显微酸性,然后加三氯化铁试液,可显紫色。阿司匹林需加热水解生成水杨酸后才显紫色,方法为:取本品约0.1g,加水10ml,煮沸放冷后,加三氯化铁试液1滴,即显紫堇色。
阿司匹林片和贝诺酯片可取细粉按原料药方法直接鉴别。阿司匹林栓剂则需提取阿司匹林后再按原料药方法鉴别,方法为:取本品适量(约相当于阿司匹林0.6g)加乙醇20ml,微温使阿司匹林溶解,置冰浴中冷却5分钟并不断搅拌,滤过滤液置水浴上蒸干,残渣照原料的方法鉴别。
2.水解产物反应阿司匹林具有酯键,在碱性条件下水解后,生成水杨酸钠和醋酸钠。水杨酸钠与游离水杨酸在水中溶解度明显不同,可利用其溶解度差异观察溶解与沉淀的现象;因醋酸有挥发性,酸化时可闻到醋酸臭味。方法为:取阿司匹林0.5g,加碳酸钠试液10ml,煮沸2分钟后,放冷,加过量的稀硫酸,即析出白色沉淀,并发生醋酸的臭气。
若为阿司匹林片剂,加热放冷后,应滤除片剂辅料等,再在滤液中进行酸化,否扰反应结果的观察。
3.芳香第一胺类的鉴别反应 此反应为芳伯氨基或潜在芳伯氨基的反应,通常也称为重氮化-偶合反应,即在酸性溶液中,具有此结构特征的药物与亚硝酸试液发生重氮化反应生成重氮盐,再与碱性B-萘酚试液偶合生成橙红色沉淀。例如,对氨基水杨酸钠具有芳伯氨基,而贝诺酯加酸发生水解反应后产生芳伯氨基,可用此反应进行鉴别贝诺酯的鉴别方法:取贝诺酯约0.1g,加稀盐酸5ml煮沸,放冷,滤过,滤液加0.1mol/L亚硝酸钠溶液数滴,滴加碱性B-萘酚试液数滴,生成橙红色沉淀。
贝诺酯片可取片粉按原料药方法直接鉴别。
(二)光谱法
1.紫外-可见分光光度法具有共轭双键、苯环或芳杂环结构的药物,在紫外可见光区有特征吸收,可用于定性鉴别。药典采用紫外-可见分光光度法鉴别贝诺酯、二氟尼柳等。
(1)贝诺酯鉴别方法:取本品适量,精密称定,无水乙醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含7.5μg的溶液,照紫外一可见分光光度法测定,在240nm的波长处有最大吸收;在240nm的波长处测定吸光度,按干燥品计算,吸收系数(
)为730～760。
(2)二氟尼柳鉴别方法:取本品,加0.1mol/L盐酸乙醇溶液溶解并稀释制成1ml中含有20μg的溶液,照紫外-可见分光光度法测定,在251nm与的315nm的波长处有最大吸收,吸光度比值应为4.2～4.6。
2.红外分光光度法 红外分光光度法具有特征性强、专属性好的特点,绝大多数药物的原料药均用红外分光光度法鉴别,制剂由于辅料的干扰,一般不采用。药典采用红外分光光度法鉴别水杨酸、水杨酸镁、阿司匹林、对氨基水杨酸钠、贝诺酯、二氟尼柳等原料药,要求供试品的红外吸收光谱应与对照图谱一致。
(三)色谱法
1.高效液相色谱法药典采用高效液相色谱法鉴别阿司匹林片、肠溶片、肠溶胶囊、泡腾片,贝诺酯片及对氨基水杨酸钠肠溶片,注射用对氨基水杨酸钠等,要求在含量测定项下记录的色谱图中,供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
2.薄层色谱法药典采用薄层色谱法鉴别二氟尼柳胶囊。方法为:取内容物适量(约相当于二氟尼柳50mg),加甲醇5ml,振摇使二氟尼柳溶解,滤过,滤液做为供试品溶液;另称取二氟尼柳对照品适量,用甲醇制成每1ml约含10mg的溶液,作为对照品溶液,照薄层色谱法试验,吸取上述两液各5μl,分别点于同一硅胶GF24薄层板上,以正己烷-二氧六环-冰醋酸(85:10:5)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外线灯(25nm)下检视,供试品溶液所显主斑点的位置和颜色应与对照品溶液的主斑点相同。
三、检查
(一)特殊杂质检查
1.阿司匹林及其制剂中特殊杂质检查
(1)游离水杨酸:由于阿司匹林在合成过程中水杨酸的乙酰化反应不完全或在贮藏过程中水解而产生水杨酸,水杨酸对人体有一定毒性,且其分子中含有酚羟基,在空气中易被氧化生成有色醌类化合物,如淡黄色、红棕色甚至棕色,从而使阿司匹林变色,故需加以控制。药典采用HPLC法检查阿司四林及其制剂中的游离水杨酸。
阿司匹林中游离水杨酸的检查方法:取本品约g,密称定,置10ml量瓶中加冰酸甲醇溶液适量,振摇使溶解,并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液(临雨新制取水杨酸对照品约10mg,精密称定,置100ml量瓶中,加1%冰醋酸甲醇溶液适量使溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取5ml,置50ml量瓶中用1%冰醋酸甲醇溶液稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液;照高效液相色谱法试验。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈—四氢呋喃—冰醋酸—水(20:5:5:70)为流动相:检测波长为303nm理论板数按水杨酸峰计算不低于5000,阿司匹林峰与水杨酸峰的分离度应符合要求。立即精密量取供试品溶液、对照品溶液各10μl,别注入液相色谱仪,记录色谱图,供试品溶液色谱图中如有与水杨酸峰保留时间一致的色谱峰,按外标法以峰面积计算,不得过0.1%。水杨酸的杂质限量按式计算
式中,As为供试品溶液的峰面积;Ar为对照品溶液的峰面积;Ds为供试品溶液的稀释倍数;Dr为对照品溶液的稀释倍数;Vs为供试品溶液的定容体积;Vr为对照品溶液的定容体积;ms为供试品的称样量;mr为对照品的称样量。
由于阿司匹林在制剂过程中易水解生成水杨酸,因此药典规定阿司匹林片肠溶片、肠溶胶囊、泡腾片及栓剂均照原料药方法与色谱条件检查水杨酸。
(2)有关物质:阿司匹林中有关物质系指除水杨酸以外的合成中引入的其他原料及副产物,如醋酸苯酯、水杨酸苯酯、乙酰水杨酸苯酯等。药典采用高效液相色谱法的面积归一化法检查,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-四氢呋哺-冰醋酸-水(20:5:5:70)为流动相A、乙腈为流动相B,梯度洗脱;检测波长为276nm;以供试品溶液(10mg/ml)的稀释液(0.5%)为对照溶液。供试品溶液色谱图中如有杂质峰,除水杨酸外,其他杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积。
2.贝诺酯中特殊杂质的检查
(1)游离水杨酸:药典采用目视比色法检查贝诺酯中的游离水杨酸。检查的原理为利用贝诺酯结构中无酚羟基,不能与高铁盐作用,而水杨酸则可与高铁盐反应呈紫色,与一定量水杨酸对照溶液生成的色泽比较,从而控制游离水杨酸的限量。方法为:取本品0.1g,加乙醇5ml,加热溶解后,加水适量,摇匀,滤入50ml比色管中,加水使成50ml,立即加新制的稀硫酸铁铵溶液1ml,摇匀,30钟内如显色,与对照液(精密称取水杨酸0.1g,置1000ml量瓶中,加水溶解后,加冰醋酸1ml,摇匀,再加水适量至刻度,摇匀,精密量取1ml,加乙醇5ml与水44ml,再加上述新制的稀硫酸铁铵溶液1ml,摇匀)比较,不得更深(0.1%)。
(2)对氨基酚:药典采用灵敏度法检查贝诺酯中的对氨基酚。其原理是利用对氨基酚碱性条件下能与亚硝基铁氰化钠生成蓝色配位化合物,而贝诺酯无此反应。
取本品1.0g,加甲醇溶液(1→2)20ml,搅匀,加碱性亚硝基铁氰化钠试液1ml,摇匀,放置30分钟,不得显蓝绿色。
(3)有关物质:贝诺酯中含有对乙氨基酚、乙扑热息痛、阿司匹林、水杨酸等多种质。药典采用HPLC法的自身稀释对照法和杂质对照品法控制其限量。以十八烷烷键合硅胶为填充剂;以水(用磷酸调节pH至3.5)-甲醇(44:56)为流动相;检测波长为240nm。以供试品溶液(0.4mg/ml)的稀释液(1%)为对照液,以10μg/ml的对乙酰氨基酚为对照品溶液,规定供试品溶液的色谐图中如有与对照品溶液主峰保留时间一致的色谱峰,其峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.1倍;其他单个杂质峰面积均不得大对照溶液主峰面积的0.5倍;各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积。
3.对氨基水杨酸钠中有关物质的检查
对氨基水杨酸钠一般以间氮基酚为原料进行合成,致使对氨基水杨酸钠中可能引入间氨基酚及反应副产物。间氨基酚不仅有,而且易被氧化变色,故药典采用HPLC法控制有关物质的限量。
(二)制剂检查
贝诺酯片溶出度的测定贝诺酯不溶于水,体内吸收受到溶解速度的影响,因要测定其溶出度。药典采用紫外-可见分光光度法测定贝诺酯片的溶出度。
测定方法:取本品,照溶出度测定法(第二法),以1%十二烷基硫酸钠溶液1000mL为溶出介质,转速为每分钟90转,依法操作、经45分钟时,取溶液10m,滤过,精密量取续滤液适量;用水稀释制成每1ml中含有贝诺酯8g的溶液,作为供试品溶液;另取贝诺对照品20mg,精密称定,置50ml量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,播匀,精密量取2ml至100ml量瓶中,用溶出介质稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。取上述两种溶液,照紫外一可见分光光度法,在240mm的波长处分别测定吸光度,计算每片的溶出量。限度为标示量的65%,应符合规定。每片的溶出量按式计算
式中,As为供试品溶液的吸光度;Ar为对照品溶液的吸光度;Ds为供试品溶液的稀释倍数;Dr为对照品溶液的稀释倍数100/2=50;V介质为溶出介质的体积1000ml;Vr为对照品溶液的定容体积50ml;mr为对照品的称样量。
2.释放度的测定 释放度系指口服药物从缓释制剂、控释制剂,肠溶制剂及透皮剂等在规定溶剂中释放的速度和程度。阿司匹林肠溶片、肠溶胶囊需进行释放度的测定。
例如,药典中阿司匹林肠溶片的释放度测定方法如下。
酸中释放量取本品,照释放度测定法,采用溶出度测定法第一法装置,以0.1mol酸溶液600ml(25mg规格)为溶出介质,转速为每分钟100转,依法操作,经2小时后取溶液10ml,滤过,取续滤液作为供试品溶液;取阿司匹林对照品,精密称定,加1%冰酸甲醇溶液溶解并稀释制成4.25μgml(25mg规格)的溶液,作为对照品溶液。照含量定项下方法测定。计算每片中阿司匹林的释放量,限度应小于阿司匹林标示量的10%缓冲溶液中释放量在酸中释放量检查项下的溶液中继续加入37℃的0.2 mol/l溶液2u5mg规格),混匀,用2mol/L盐酸溶液或2mL氢氧化钠溶液调节溶液的pH为6.8±0.05,继续溶出45分钟,取溶液10ml,滤过,取续滤液作为供试品溶液。
另取阿司匹林对照品适量,精密称定,用1%冰醋酸甲醇溶液溶解并稀释制成22μg/ml(25mg规格)的溶液,作为阿司匹林对照品溶液;另取水杨酸对照品,精密称定,用1%冰醋酸甲醇溶液溶解并稀释制成1.7μg/ml(25mg规格)的溶液,作为水杨酸对照品溶液。照含量测定项下色谱条件,精密量取供试品溶液、阿司匹林对照品溶液与水杨酸对照品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。按外标法计算出每片中阿司匹林和水杨酸的含量,将水杨酸含量乘以1.034后,与阿司匹林含量相加即得每片缓冲溶液中的释放量。限度为标示量的70%。
四、含量测定
(一)酸碱滴定法
阿司匹林结构中游离羧基的酸性,其电离常数为3.27×10-4,可采用标准碱滴定液直接滴定。
测定方法:取本品约0.4g,精密称定,加中性乙醇(对酚酞指示液显中性)20ml溶解后,加酚酞指示液3滴,用氢氧化钠滴定液(0.1mol/)滴定。每1ml氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于18.02mg的C9H8O4。按干燥品计算,含C9H8O4不得少于99.5%。
阿司匹林具有酯的结构,为了使阿司匹林易于溶解并防止其酯键在滴定时水解而致使测定结果偏高,故不用水为溶剂,而选用中性乙醇溶液溶解供试品。本品属于弱酸,用强碱滴定时,化学计量点偏碱性,故指示剂选用在碱性区变色的酚酞。滴定时应在不断振摇下稍快地进行,以防止局部碱度过大而促使其水解。试验表明当温度在0～40℃时,对测定结果几乎没有影响。供试品中所含水杨酸超过规定限度时,不宜用直接滴定法测定。
(二)紫外-可见分光光度法
本类药物的结构中有共轭系统,具有紫外吸收,可采用紫外-可见分光光度法测定其含量。
(三)高效液相色谱法
为了分离原料药的制剂中的杂质、辅料及稳定剂等,药典采用高效液相色谱中的外标法测定阿司匹林各种制剂、对氨基水杨酸钠及其制剂、贝诺酯及其片剂的含量。
例如,阿司匹林片的含量测定方法为:取本品20片,精密称定,充分研细,精密称取细粉适量(约相当于阿司四林10mg),置100ml量瓶中,用1%冰醋酸甲醇溶液强烈振摇使阿司匹林溶解,并用1%冰醋酸甲醇溶液稀释至刻度,摇匀滤膜滤过,精密量取续滤液10μ注入液相色谱仪,记录色谱图。另取阿司匹林对照品,精密测定,加1%冰醋酸溶液振摇使溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.g的溶液,同法测定。按外标法以峰面积计算,即得。阿司匹林片标示量的百分含量按式阿司匹林片标示量%=计算:
式中,Cr为对照品溶液的浓度;Ar为对照品峰面积;AS为供试品峰面积;D为稀释倍数,1;V为定容体积,100ml;ms为供试品的取样量(g)。
五、其他水杨酸类药物的质量检测
除上述介绍的药物外,《中国药典》二部还收载了其他水杨酸类药物,其检测项目与方法各异。
