一、中期染色体核仁形成区的银染和观察 1. 取制备好的正常或肿瘤细胞染色体标本,直接放入装有5 N HCl溶液中,常温处理5分钟。 2. 用自来水反复冲洗几次,甩干,标本面朝上平放在平皿中。 3. 将0.1%甲酸临用前配制的50%AgNO,溶液约0.5 ml,用吸管滴在标本上,再盖上二片擦镜纸。 4. 放置平皿于56℃水浴中处理3~5分钟,待擦镜纸呈棕色后,取出标本用水冲洗、气干。 5. 镜检 (1)镜下所见标本背景浅黄色,核型深染,端着丝粒染色体的银染蛋白存在的部位呈棕黑色颗粒,选择染色体分散良好,银染颗粒清楚的分裂相,进行计数单侧或双侧有银染颗粒的染色体数。 (2)人体细胞银染颗粒有遗传稳定性,一般正常值为4~8个/核型。 (3)计算方法:NOR 均值=N个核型中含NOR染色体数的和/N个核型 二、间期细胞核活性核仁形成区的银染与观察 1. 收集培养的HL-60细胞和用PHA转化的人正常外周血淋巴细胞分别于离心管中,用1 000 rpm 离心5分钟后弃上清。 2. 用吸管吸打或用指弹法使细胞悬浮,然后用Carnoy固定液固定30分钟。 3. 以1 000 rpm 离心5分钟,弃上清剩约0.5~0.1 ml 液体,使细胞悬浮后滴片。 4. 37℃干燥24小时 5. 银染 6. 镜检 (1)镜下所见,细胞核着色而细胞质不着色,核中活性核仁形成区银染颗粒呈棕黑色,成簇聚集,清晰可分。 (2)肿瘤细胞中与正常细胞中的银染颗粒数量、可见有明显差异。 三、间期细胞核银染活性核仁形成区电镜标本制备与观察 1. 收集培养的HL-60细胞或HeLa细胞于离心管中,随后加入2.5%戊二醛1 ml 预固定10分钟。 2. 以1 000 rpm 离心10分钟,弃上清后加入Carnoy固定液固定5分钟。 3. 接着以2 500 rpm 离心10分钟,弃净上清并用吸水纸吸干残余液体,用耳勺取出细胞团块放于小平皿中。 4. 100%乙醇→双蒸水梯度复水,每步5分钟。 5. 然后将细胞团切成约1 mm3大小的块。 6. 将50%AgNO3(用蒸馏水配制)-2%蛋白胶(用1%甲酸配制)2:1混合液2~3 ml,加入有细胞团块的小平皿中。 7. 移置平皿于56℃水浴中处理20分钟。 8. 彻底水洗3次,每次2~3分钟。 9. 水洗后5%硫代硫酸钠室温处理10分钟。 10. 再水洗3次,转入乙醇一丙酮梯度脱水,每步5分钟。 11. Epon812包埋。 12. 超簿切片直接地或再经醋酸铀和柠檬酸铅复染后,在电镜下观察。
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