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荧光原位杂交实验——基本方案

2019.3.25

实验材料	样品
试剂、试剂盒	DNA探针非同位素甲酰胺杂交混合液甲酰胺 Triton X-100 SSC
仪器、耗材	相差显微镜盖玻片水浴锅加湿盒滤光片荧光显微镜
实验步骤	1a. 石蜡切片或细胞的杂交：按石蜡切片或细胞的原位杂交实验的基本方案步骤1~7，对载玻片进行脱蜡、水化、封闭和脱水处理。将标本晾干（或在干燥器中干燥），随后贮于加有干燥剂的载玻片盒中，置-70℃过夜。 1b. 冰冻切片的杂交：按冰冻切片的原位杂交实验的备择方案步骤1~7，进行切片的预处理和乙酰化处理，随后进行切片的脱水。 2. 对每一杂交实验，可用乙醇沉淀10~15 ng 探针，重溶于10 ml 去离子的甲酰胺中，加5 ug（0.5 ul）超声处理的鲑精DNA，在70~80℃温度下热变性探针10 min。 3. 加10 ul 主杂交混合液于变性探针中（探针终浓度为0.1~0.5 ug/ul 混匀），微量离心机以高速稍加离心，然后加于载玻片上。覆加22 mm² 盖玻片，轻压以赶去大的气泡。放入加湿盒中，在37℃温育2~4 h。 4. 杂交最后30 min 期间，以37℃水浴，在Coplin 广口瓶中，预热50 ml 50%甲酰胺/2xSSC洗液和50 ml 2xSSC。 5. 从加湿盒中取出载玻片，剥去橡皮泥（如有使用的话）并小心移去盖玻片。在37℃ 50%甲酰胺/2xSSC中，清冼杂交过的玻片15 min；接着以37℃ 2xSSC洗15 min；再于室温以1xSSC洗15 min。 6. 玻片在室温下，以4xSSC平衡5 min。取出载玻片吸去残余缓冲液，在此过程中任何时候都不要使玻片干涸。 7. 加50 ul 生物素检测液，地髙辛检测液或生物素/地高辛检测液于杂交过的载玻片上。用22 mm² 的Parafilm 膜覆盖，放在一用铝箔包裹的加湿盒中，于37℃温育45 min。 8. 室温下，按顺序在裹以铝箔的Coplin 广口瓶中，分别用4xSSC、0.1%Triton X-100/4xSSC和4xSSC浸洗切片。毎种溶液中浸洗10 min。 9. 加50 ul DAPI 或碘化丙锭染色液于切片上，以一块22 mm² 的Parafilm 膜覆盖。室温下染色5 min。在盛有1xSSC的Coplin 广口瓶中快速浸洗，以除去多余染液。吸去残液但不要使切片干涸。 10. 加7 ul 适当的防褪色固片介质于已染色的切片上，覆以盖玻片。轻轻挤压除去多余的防褪色固片介质，注意勿损伤组织切片。以指甲油密封盖玻片，放在有干燥剂的玻片盒中，贮于-20℃。 11. 用具落射光源，以及有适合实验中所用荧光染料的滤光片的荧光显微镜，观察实验结果。 12. 用Ektar-1000或Ektachrome-400彩色感光片照相。