细胞的冻存实验主要用于：（1）长时间保存细胞系；（2）防止细胞保存液内产生冰晶。
| 实验方法原理 | 已长满的细胞经胰蛋白酶处理后，重悬于冻存液中。两种试剂即甘油和 DMSO 是常用的细胞保护剂，它们在细胞保存液中起到防止细胞内冰晶形成的目的。血清的浓度经常增加至 20%。 |
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| 实验材料 | 细胞 |
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| 试剂、试剂盒 | 胰蛋白酶冻存液 |
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| 仪器、耗材 | 细胞冻存器 |
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| 实验步骤 | 1) 吸干已长满细胞的细胞瓶内培养液。
细胞不应在高密度状态下冻存，并应在冻存的 24 小时内换液。
2) 加 2 ml 胰蛋白酶（T-25 细胞培养瓶）处理细胞。
3) 让液体在细胞表面来回流动 4~5 次。
4) 吸干胰蛋白酶液。
5) 重复步骤 3 和 4。
6) 置 37°C 3~5 分钟。
7) 将细胞从细胞培养瓶表面洗下，重悬细胞于 3~5 ml 培养液中。
8) 离心，200 g，5 分钟；重悬沉淀于 1 ml 冻存液中。
冻存液
细胞生长培养液（RPMI,DMEM 等） 7 ml
FBS 2 ml
甘油或 DMSO 1ml
小心：甘油；DMSO
甘油或 DMSO 的浓度介于 5%~20% 之间。生长培养液的体积应调整以适于所用细胞保护剂的变化。
如果欲冻存悬浮细胞，沉淀 5x106~10x106 对数生长期细胞，重悬沉淀于 1 ml 冻存液中。
9) 加入 1 ml 细胞（单层细胞约为 3x106~5x106; 悬浮细胞约为 5x106~10x106) 于
冻存管上标明细胞系的名称、日期和生长培养液。
10) 置冻存管于 Nalgene 细胞冻存器中，并让细胞冻存管在-80°C 过夜或利用可控速率的冷冻装置。
11) 次口，将冻存管转移至液氮中。此步骤操作宜迅速，冻存液不应融化。 展开 |
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| 注意事项 | 将冻存管转移至液氮中。此步骤操作宜迅速，冻存液不应融化。 |
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| 其他 | 将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存。
来源《细胞实验指南（上册)》作者：黄培堂。 |
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