腺相关病毒（AAV）在动物实验中的应用
腺相关病毒属于微小病毒科 (parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒，基因组大小约 4.7 kb。利用腺相关病毒可以将外源基因转入动物组织和细胞中，具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、表达稳定等多种优点，广泛应用于动物体内研究。
腺相关病毒血清型众多(12种)，不同血清型对不同组织亲和性不同。因此在具体科学研究中，以下问题往往困扰着广大科研工作者：选择何种血清型？如何注射？注射多少病毒？注射部位如何选择？注射多久检测？
本文就常见的注射部位（大脑、视网膜、肝脏、心脏和动脉、肺脏、肾脏、肌肉、肠）和方法做一个简单的归纳，为大家提供一个概念和思路。
一、大脑
大脑组织常用血清型有 AAV1，AAV2，AAV5，AAV8 和 AAV9，其中神经组织常见的血清型有 AAV2，AAV5 和 AAV8。对大脑组织而言，AAV5 应用范围更广，AAV8 更有效（值得注意的是，在猴子的神经组织中，AAV5 更有效）。从作用效果上看，AAV8 大于 AAV1。
针对大脑组织不同部位，AAV 不同血清型靶向性有所差异：
1）海马组织：AAV9 比 AAV8 更有效；
2）神经组织不同的细胞，不同血清型靶向性不同：如神经元常用的血清型有AAV1、AAV2、AAV5 和 AAV9；星形胶质细胞和少突胶质细胞常用的血清型有 AAV1 和 AAV5 。
总体而言，在所有组织中，AAV2 适用性广且在脑部组织也有所体现，例如其可以达到大脑组织 75% 的区域。AAV2、AAV5、AAV8 和 AAV9 也比较常见，应根据不同组织进一步慎重选择，在此介绍几种特例：
1、肠神经系统(Enteric Nervous System ENS)，是由神经细胞组成的复杂网络，遍布整个肠胃消化管道。其神经元的数量和脊髓相当(约1亿个神经细胞)。该神经系统在人体躯干下部，属于迷走神经，以薄层的形式分布于消化肌之间，调节消化。常用 AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9 ，AAV6 对肠神经胶质和神经元有一定的靶向性。注射部位可以选择降结肠，注射量和滴度： 滴度为 1.3 × 10^12 GC/ml的病毒注射 5 μl 即可。检测时间：注射后 2 周开始表达，2-6 周均有检测。
2、脑组织常见的血清型为 AAV9，注射方法：左心室注射或者侧脑室注射。注射剂量和滴度：选择滴度为 0.5–4.0×10^11 GC/ml 的病毒液，稀释成 100 μl ，注射两周之后(14d) 开始检测。下图为一些脑部组织注射情况：
Fig1. Transduction and phenotyping of transduced cells in the cerebral cortex
Fig 2. Transduction of cells in the hippocampal formation.
Neuroscience 138 (2006) 501–510
Fig3. Transduction efficiency of recombinant adeno-associated virus (AAV) in the myenteric plexus (MP) of the enteric nervous system:a comparison across serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9
Fig4. Neuronal tropism of recombinant adeno-associated virus (AAV) transduction in the submucosal plexus (SMP): serotypes 1, 2, 5, 6,8, and 9.
Molecular Therapy vol. 23 no. 3 mar. 2015
二、视网膜
视网膜组织常用血清型有 AAV1、 AAV2 和 AAV5 。视网膜组织由于其特殊性，因而有自身的特点：注射成功率 20-30%，容易造成视网膜炎症和损伤，注射完需要使用 1% 阿托品（和少量新霉素、多粘菌素B硫酸盐和地塞米松眼膏施用于眼睛，延长瞳孔扩张时间，减少腺体分泌，减少炎症反应），连续使用 3-5 d 。其常用的注射量为 0.5 μl ，病毒滴度 1.5x10^7 GC/ml 。常用注射方法：视网膜下注射或者玻璃体注射。
但不同血清型又有不同特点：AAV1 主要作用于视网膜上皮细胞，注射后 2-4 周可以检测；AAV2 主要作用于感光细胞、视网膜上皮细胞和玻璃体，AAV2 玻璃体注射后分布广泛，2-4 周可以检测； AAV5 可作用于视网膜上皮细胞和感光细胞，在感光细胞中表达 AA5>AAV2，2-4 周检测。下图为一些视网膜组织的注射情况：
Fig 5. AAV added to the retinal ganglion cell surface in culture vs. intravitreal injection in vivo.
Vision Research 48 (2008) 377–385
三、肝脏
AAV2、AAV5、AAV7 和 AAV8，其中 AAV7 和 AAV8 的效率是 AAV2 的 10-100 倍。注射部位常选择门静脉、外周静脉和尾静脉。注射病毒滴度一般选择 8×10^10-2×10^12(GC/kg)（人、灵长类）；1×10^11 GC/只鼠，稀释成 50-100 μl 进行尾静脉注射；注射 2 周之后可以检测。下图为肝脏注射的一些情况：
Fig 6. In vivo vector specificity analysis
四、心脏和动脉
对心脏和动脉而言，常用血清型有：AAV1、AAV6、AAV8 和 AAV9 。其中 AAV2、AAV5、AAV7 也可以使用，但是表达比较慢，3 个月后表达量才能与 AAV1、AAV6 表达量相当。所有血清型中 AAV8 和 AAV9 最有效，2 个月左右其表达量达到最高。
常见的注射部位为冠状动脉、主动脉、心肌和尾静脉。注射病毒滴度为 1.9×10^11-10^12 GC/ml，稀释成 100 μl -250 μl（大鼠剂量稍高于小鼠）注射；但是对于心脏原点注射而言，常采用 10^10 GC/ml 病毒滴度，稀释成 20 μl 使用。检测时间：一般在2周之后可以检测。下图为注射的一些情况：
Biodistribution of LacZ expression and vector genomes 4 weeks after direct injection of 5 ×1011 vg of AAV8 -and AAV9-CB-LacZ into the rat heart., heart； Li, liver； Lu, lung； Br, brain； Te, testis； Ki, kidney； Sp, spleen； St, stomach； Ga, gastrocnemius.
HUMAN GENE THERAPY 19:1359–1368
五、肺脏
肺脏常用血清型有 AAV1、AAV2、AAV5、AAV6 和 AAV9。由于肺脏表面唾液酸受体分布比较多，因此 AAV5 型比较常用；相比之下 AAV2 和 AAV6 转导效率相当。常见的注射方式有滴鼻、雾化吸入或气管内注射，注射病毒滴度为 10^12 GC/ml ，稀释成 3 μl，注射完之后 2 周可以检测表达情况。下图为注射的一些情况：
Histochemical detection of AP expression in mouse lungs 1 month after vector exposure.
JOURNAL OF VIROLOGY, Feb. 2000, p. 1524–1532
六、肾脏
肾脏常用血清型有 AAV2、AAV8 和 AAV9。注射病毒的滴度一般选择 1-5×10^11 GC/ml，稀释成 50-200 μl 注射。常见的注射部位有肾动脉、肾静脉和左髂脉、腹主动脉，注射完 2 周之后可以检测表达情况。下图为注射的一些情况：
In vivo long-term transduction by AAV serotype 2 vector into the rat kidney.
Nephron Exp Nephrol 2004；96 :e119–e126
七、肌肉
肌肉组织常用血清型有 AAV2、AAV8 和 AAV9。其中 AAV8、AAV9 最常用，心肌、胰腺和肾上腺也是如此。骨骼肌分为快速和慢速肌纤维，AAV2 常作用于慢速肌纤维，AAV6 则对二者都有效。对不同年龄阶段的鼠，注射剂量有所不同：幼鼠选择的病毒量为 7×10^10-1.2×10^11 GC/g；成年鼠选择的病毒量为 3.5 ×10^11-7×10^12 GC/只；但是低剂量的 AAV9 不能到达所有心肌细胞。下图为注射的一些情况：
Transduction of muscle fibersby different AAV serotypes.
J Gene Med 2005； 7: 442–451.
Representative photomicrographs of sections of skeletal muscle
MOLECULAR THERAPY Vol. 14, No. 1, July 2006
八、肠
肠组织常用血清型有 AAV1、AAV2 和 AAV5。常见的注射方式有口服、灌肠、腹腔注射、肠系膜动脉注射。一般选择注射滴度 1×10^11 GC/ml ,稀释成 100 μl（PBS或者稀释液稀释）使用，注射 2 周后可以检测。
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