实验室分析方法--体积排阻色谱法原理及发展
体积排阻色谱法(SEC)又称凝胶色谱法,通常用于分子量大于2000的样品的分离。SEC方法最广泛的用途是测定聚合物的分子量分布,对某些大分子样品如蛋白质、核酸等,也是种很有效的分离纯化手段。SEC方法能简便快速地分离样品中分子量相差较大的组分,因而适合于未知样品的初步探索性分离,无需进行复杂实验就能较为全面地了解样品组成分布的概况。
SEC方法按其流动相体系通常分为两大类,即适合于分离水溶性样品的凝胶过滤色谱(GFC)和适合于分离油溶性样品的凝胶滲透色谱(GPC),两种方法的分离原理虽然相同但采用的固定相、分离对象和使用技术完全不同。
一、原理与色谱柱推荐
体积排阻色谱法依据固定相凝胶的孔容及孔径分布、样品分子量大小及其分布以及相互匹配情况实现样品的分离。由图1,在固定相确定的分子量范围内,洗脱顺序按照分子大小分布。当样品分子量较大,以至于被完全排除在固定相微孔之外时(全排阻),其保留体积等于色谱柱内微粒间的空隙体积;而分子量足够小的分子可以完全进入微孔中,其保留体积为空隙体积和固定相中微孔体积之和。固定相的分子量测定范围即为全渗透和全排阻之间的分子量范围。
图1 体积排阻色谱法分离机制
理想的体积排阻色谱固定相应具有窄的孔径分布范围,而系列色谱固定相应具有宽范围的孔径分布,可根据样品的不同选择不同分子量范围的SEC柱,也可将不同规格的SEC柱串联使用,用于分离更大分子量范围的样品。“混合柱床”是将不同孔径固定相混合装填在支色谱柱中,与单分散固定相色谱柱相比,其具有更宽的孔径分布,可用于分离更大分子量范围的样品。
凝胶色谱固定相包括具有确定孔径的半刚性的交联聚合物凝胶和刚性的无机凝胶两大类,不同的凝胶在性能、使用及装柱方法等方面存在明显差异。常用的聚合物凝胶包括葡聚糖或琼脂糖凝胶、二乙烯基苯、丙烯酸酯、聚苯乙烯等。其中交联苯乙烯或象甲基丙烯酸酯凝胶多用于合成高分子的分离;联苯乙烯主要用于油溶性化合物的分离而交联甲基丙烯酸酯柱则多用于水溶性合成高聚物的分离。无机凝胶主要是硅胶,激粒径通常为5~10μm,孔径范围为50nm~0.1μm,能够在含水流动相和极性有机溶剂中使用,一般于生物大分子的分离。无机凝胶在高压或高流速下柱床稳定,热稳定性好能够长期使用。
二、流动相
体积排阻色谱法中,实际的分离效果与样品、流动相之间的相互作用无关,因此改变流动相的组成一般不会改变分离度。当采用示差折光检测器时,为提高检测灵敏度,应使流动相的折射率与被测样品的折射率有尽可能大的差别。若使用紫外吸收检测器,也应采用在检测波长无紫外吸收的溶剂。
体积排阻色谱法中流动相的选择原则:
①流动相对样品应有足够的溶解能力,黏度小,与检测器匹配;
②流动相必须与固定相匹配,能浸润凝胶,如对苯乙烯二乙烯基本聚合物固定相选择非极性流动相;多孔硅胶固定相应选择极性强的流动相
③为增加样品溶解度而采用高柱温操作时,应选用高沸点溶剂;
④为消除排阻效应,针对不同固定相,流动相中应保持一定离子强度,并选择与固定相作用强于样品的溶剂为流动相。
凝胶渗透色谱主要用于高聚物分子量的测定。四氢呋喃对此类样品有良好的溶解性能,可使小孔径聚米乙烯凝胶溶胀,甜度也较低,因此被广泛使用作为GPC流动相。但因其在储运过程中特别是在光照射条件下,容易生成过氧化物,使用前必须除去。二甲基甲酰胺、邻二氯苯、间甲酚等溶剂可在高柱温条件下使用;强极性的六氟异丙醇、三氟乙醇等可用于粒度小于10μm的凝胶柱。
在凝胶过滤色谱中,通常以具有不同pH值的缓冲溶液作为流动相。当采用亲水性有机凝胶(葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等)、硅胶或改性硅胶为固定相时,固定相与样品间可能存在多种相互作用影响GFC测定准确性,可在流动相中添加少量无机盐以保持定的离子强度(0.1~0.5mol/L),其中钠、钾、铵等的硫酸盐、磷酸盐消除吸附作用的效果较好。当使用硅胶基质凝胶时,流动相的pH值应保持在4~8的范围,以免硅胶键合相被破坏。
三、方法发展
建立SEC方法时,应选用分子量范围能覆盖所有样品组分分子量的色谱柱。除了根据样品分子量选择固定相的孔径大小外,还需根据样品特征选择固定相种类。小颗粒硅胶固定相可以在高流速下使用,分离速度快,是分析型SEC首选。
GPC分离中,通常采用标准曲线法测定高分子物质的分子量。选用与被测样品类型相似的窄分布(单分散)标样在同一条件下分离,以保留体积对分子量的对数作图,在一定分子量范围内得到相对分子质量的标准曲线,见图2。
体积较大的溶质分子难以进入到固定相的孔内,因此被先洗脱出来,使分子量-洗脱体积曲线的线性范围与待测样品的分子量范围匹配。
