实验室分析方法--正相液相色谱法原理及发展
正相液相色谱(NPLC)是最常用的HPLC分离方法之ー。与RPLC相反,其固定相极性大于流动相,样品的保留值随流动相极性降低而增加。NPLC常用于分离中性和离子样品。
一、原理与色谱柱推荐
正相液相色谱为典型的液-固吸附色谱。溶质在柱中固定相上反复进行吸附-解吸过程,根据不同被测物在吸附剂上吸附作用的强弱进行分离。其分离机理如图1所示。
图1 正相色谱机理
溶质和固定相间的吸附作用包括:①溶质和溶剂分子对吸附剂表面特定位置的竟争作用,这使得溶剂组成的改变往往会引起分离情况发生很大变化;②溶质所带官能团与吸附剂表面相应的活性中心之间的相互作用,这种作用与溶质分子的几何形状有关,当官能团的位置与吸附中心匹配时,保留较强;反之,则保留较弱。
溶质所带官能团的性质是决定其吸附作用的主要因素,若溶质分子所带官能团的极性强、数目多,则保留也强。不同异构体的相对吸附作用常有较大差异,因而,正相色谱法分离异构体比其他色谱法更为优越。
固定相一般采用硅胶、氧化铝和极性基团键合的硅胶等。硅胶是最常用的正相色谱固定相,已经被广泛应用于环境样品、石油化工样品的分析方法建立。由于在高pH值时硅胶能够溶解,要获得满意的使用寿命,不应在pH=8以上使用某些硅胶基质的色谱柱。此外,硅胶基质表面的酸性使其不适宜分离碱性化合物。
Al2O3作为正相色谱固定相对不饱和化合物特别是芳香族化合物、多核芳烃有较强的保留能力,可以将芳烃异构体良好分离;此外,当样品为碱性化合物时,若使用硅胶则会造成严重吸附,溶质峰拖尾或难以洗脱,此时宜选用Al2O3进行分离。
极性键合相一般指键合有机分子中含有某种极性基团,与硅胶相比,这种极性键合相表面上能量分布相对均匀,因而吸附活性也比一般的硅胶低。最常用的有氰基(一CN)、醇基(Diol)、氨基(一NH2)等。极性键合相的极性通常弱于硅胶,所以更适于对中等物质的分离。
氨基键合相固定相的吸附过程与SiO2相似但又有所不同,如图2所Si—OH呈酸性,而ーNH2呈碱性,所以用于正相冲洗时表现有不同的选择性。一NH2具有强的氢会能力,对某些多官能团化合物,如甾体、强心等有较强的分离能力。在酸性介质中,这种键合相作为一种离子交换剂,可用于分离酚、羧酸、核苷酸等。氨基可与糖类分子中的羟基发生选择性相互作用,因而用乙腈—水做流动相时可以分离单、双和多糖,这已成为一种策类分析的常规方法。此时尽管从流动相角度看为反相,但从机理上讲为正相色谱,因为流动相中水含量的增加使溶质的保留值降低。
氰基键合相的分离选择性与硅胶相似,但因极性比硅胶弱,所以在相同流动相条件下的保留值较硅胶小;或者若要维持相似的保留值,可用极性更小的流动相冲洗。氰基键合相与某些含有双键的化合物发生选择性相互作用,因而对双键异构体或含有不等量双键数的环化合物有更好的分离能力。
二醇基键合相是缩甘油氧丙基硅烷键合相的水解产物[Si(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OH]对有机酸和某些低聚物可获得好的分离。二醇基的另一个用途是可进行某些蛋白质的水系体积排阻色谱分离。
二、流动相
在正相液相色谱中,由于固定相的极性大于流动相的极性,所以增加流动相的极性,洗脱能力増加,样品的保留值降低。一般地,应选择极性适当溶剂,使样品的1<k'<10。
正相液相色谱以非极性或弱极性溶剂为流动相,溶质与流动相的相互作用较弱,通常是在饱和烷烃(如正己烷)中加入一种极性较大的溶剂(如异丙醚)作为极性调节剂构成的混合溶剂。混合溶剂系统的溶剂强度可随其组成连续变化,易于找出具有适宜溶剂强度的溶剂系统。混合溶剂也可以保持溶剂的低黏度,以降低柱压和提高柱效,以及提高选择性,改善分离。调节极性调节剂的种类和浓度可以改变溶剂的强度从而改变分离选择性。对于难以达到所需要分离选择性的情况,还可以考虑使用三元或四元溶剂体系。
正相色谱一般为吸附色谱,常用的溶剂可按其对固定相的吸附强度进行分类,通常以溶剂强度参数ε0值作为衡量溶剂强度的指标。ε0被定义为:
式中,E为吸附能;A为吸附剂的表面积。显然,ε0表示溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能,ε0越大,固定相对溶剂的吸附能力越强,则溶质的k'值越小,即溶剂的洗能力越强。表1列出了正相色谱中以硅胶为吸附剂时常用溶剂的溶剂强度参数。
正相色谱中溶质分子的k'值随溶剂ε0值的增加而下降,因此溶剂洗脱能力顺序可用于寻找最佳的溶剂强度。表2列出了正相色谱中以硅胶为吸附剂时一些二元流动相的洗脱能力顺序。
表1 常用溶剂的洗脱能力
溶剂 | 溶剂强度ε0 | 溶剂 | 溶剂强度ε0 |
正己烷 | 0.00 | 乙酸乙酯 | 0.38 |
异辛烷 | 0.01 | 二噁烷 | 0.49 |
四氯化碳 | 0.11 | 乙腈 | 0.50 |
四氯丙烷 | 0.22 | 异丙醇 | 0.63 |
氟仿 | 0.26 | 甲醇 | 0.73 |
二氯甲烷 | 0.32 | 水 | 20.73 |
四氢呋喃 | 0.35 | 醋酸 | 20.73 |
乙醚 | 0.38 |
表2 硅胶柱上液—固色谱洗脱剂的溶剂序列
ε0 | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ |
0.00 | 戊烷 | 戊烷 | 戊烷 |
0.05 | 42%氯化异丙烷—戊烷 | 3%二氯甲烷—戊烷 | 4%苯—戊烷 |
0.10 | 10%氯化异丙烷—戊烷 | 7%二氯甲烷—戊烷 | 11%苯—戊烷 |
0.15 | 21%氯化异丙烷—戊烷 | 14%二氯甲烷—戊烷 | 26%苯—戊烷 |
0.20 | 4%乙醚—戊烷 | 26%二氯甲烷—戊烷 | 4%乙酸乙酯—戊烷 |
0.25 | 11%乙醚—戊烷 | 50%二氯甲烷—戊烷 | 11%乙酸乙酯—戊烷 |
0.30 | 23%乙醚—戊烷 | 82%二氯甲烷—戊烷 | 23%乙酸乙酯—戊烷 |
0.35 | 56%乙醚—戊烷 | 3%乙腈—苯 | 56%乙酸乙酯—戊烷 |
0.40 | 2%甲醇—乙醚 | 11%乙腈—苯 | |
0.45 | 4%甲醇—乙醚 | 31%乙腈—苯 | |
0.50 | 8%甲醇—乙醚 | 乙腈 | |
0.55 | 20%甲醇—乙醚 | ||
0.60 | 50%甲醇—乙醚 |
在实际分离中,正相液相色谱的分离选择性不仅取决于°,还受溶质与溶剂分子间的氢键作用等其他相互作用影响。预测α值随溶剂组成的变化时,应遵循以下规则:
①当强溶剂浓度很大或很小时,一般会得到较大的α值;
②含醇的溶剂系统常常会得到与其他溶剂系统不同的α值
③含强碱性或非碱性强溶剂组分的溶剂系统可能达到较大的α值
三、方法发展
正相液相色谱方法建立的一般模式与反相液相色谱类似。正相液相色谱的色谱柱选择范围较宽,氰基柱通常是首选;与氰基柱相比,硅胶柱可获得更大的值,适合于异构体和疏水性溶质的分离,但分析时必须严格控制流动相中水含量,也不适于梯度分离:二醇基柱和氨基柱稳定性较差,仅在其他类型正相色谱柱无法完成分离时采用;氧化铝柱具有独特的分离选择性,但有柱效低、保留值不定、回收率低等缺点,很少使用。
一般来说,柱尺寸为0.46cm×25μm×5μm,初始流速设为2ml/min,柱温为35℃或室温,初始进样量较大,但不应超过50μl或50μg。
正相液相色谱流动相首选是正己烷和丙醇组成的混合溶剂,正已烷-丙醇不仅在低紫外波长区吸收较弱,还可提供较宽的溶剂强度范围,适于分离极性差异较大的样品。除正己烷外,溶解性较好的1,1,2—三氟三氯乙烷(FC113)也可作为混合溶剂中的A溶剂,由于在低波长吸收较强,只能用于235m以上的检测,并且其对臭氧的破坏作用也限制了其使用。除丙醇外,B溶剂还可采用二氯甲烷、甲基叔丁醚、乙酸乙酯、乙腈等,其中丙醇适于低波长检测(<215m)条件下强极性样品的分离:二氯甲烷是高波长(>235nm)检测条件下的B溶剂首选,但洗脱强度较低:甲基叔丁醚和乙酸乙酯可在225nm以上波长使用,其加入可改变α值:乙腈也可改变样品的α值,并在195mm以上波长范围均无明显紫外吸收,但是与正己烷的混溶性较差,需要另外加入共溶剂才可使用。
与反相液相色谱方法优化过程相似,可采用0~100%丙醇-正己烷初始梯度在氰基柱上进行初始条件分离,根据结果调整梯度程序或估算等度分离条件。为了调节分离选择性,可调节B%或采用两种B溶剂,但流动相中通常不应超过三种溶剂。当仅改变流动相组成效果不明显时,可改变柱类型以获得更好的分离效果。
在正相液相色谱柱上,流动相中的极性溶剂与固定相相互作用较强,调整流动相比例时需要更长的平衡时间(至少20倍柱体积)。
水是强极性溶剂,与硅胶或氧化铝键合相当牢固,流动相中含有的微量水分会被固定相从流动相中萃取出来,导致保留时间下降。流动相中水分受到空气湿度影响,难以保证流动相的含水量固定不变,因此,采用硅胶柱时,通常会用一定量的水平衡流动相,保证含水量稳定。
