蛋白质中氨基酸外消旋化修饰非特定位点分析方法研究
王佳凤1,2，王生伟3*，李博1,2**，狄斌1,2
（中国药科大学药学院药物代谢研究中心，江苏 南京 210009）
*通讯作者：刘李，教授
[摘要]
近年来研究发现体内维生素 A 类物质（包括视黄醇、视黄醛和视黄酸）在糖尿病的发生发展中起到重要的调节作用，视黄酸是维生素 A 在体内的主要代谢产物，同时也是体内重要的活性物质之一，可以激活视黄酸受体和视黄醇类 X 受体，从而调节体内大量基因的表达，参与多个生理过程，如生殖、免疫和新陈代谢。糖尿病状态下体内视黄酸浓度紊乱，反之体内视黄酸失衡也会使糖脂代谢紊乱，从而影响糖尿病的进程。对视黄酸在糖脂代谢、胰岛素分泌和胰岛素抵抗中的作用研究进行综述，并探讨视黄酸与糖尿病之间的关系。
维生素 A（视黄醇）是人体所必需的脂溶性维生素，任何动物自身不能合成维生素 A，必须从食物中摄取
[1]。维生素 A 能调节生殖、免疫、视觉和新陈代谢，并维持皮肤、肺、骨髓、肝脏和神经系统的正常功能
[2-3]。在正常生理条件下，维生素 A 主要存在于肝脏、脂肪和胰腺等组织，体内 80% 的维生素 A 以视黄醇酯的形式储存在肝脏星型胶质细胞胞质的脂滴内
[4]。在体内，维生素 A 首先由视黄醇脱氢酶（retinol dehydrogenase，RDH）和醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）氧化成视黄醛，视黄醛再经由视黄醛脱氢酶（retinal dehydrogenase， RALDH）不可逆氧化成视黄酸，视黄酸是维生素 A 参与生理过程的主要活性物质
[5]。视黄酸同时也经细胞色素酶（CYP450 酶）中的 CYP26 家族代谢成非活性的 4-羟基视黄酸等极性代谢物，且视黄酸的分解代谢是维持细胞和组织视黄酸水平的关键
[6-7]。视黄酸以多种异构体形式存在，体内视黄酸主要有全反式视黄酸（all-trans retinoic acid，atRA）、9-顺式视黄酸（9-cis retinoic acid，9-cis RA）、13-顺式视黄酸（13-cis retinoic acid，13-cis RA）和 9，13-顺式视黄酸（9，13-cis retinoic acid，9，13-cis RA）。其中 atRA 是体内的最主要的异构体形式 [8]。视黄酸主要通过激活视黄酸受体（retinoic acid receptor， RAR）和视黄醇类 X 受体（retinoid X receptor， RXR）来调控基因表达和蛋白的产生，RAR 和RXR 可与其他核受体形成同源或异源二聚体，包括RAR、肝脏 X 受体（liver X receptor，LXR）、过氧化物酶体增殖激活受体（peroxidosome proliferators activate receptors，PPAR）等
[9-10]。据报道，视黄酸可调控 500 多种基因，并且参与肥胖、糖尿病、肿瘤、精神类疾病等疾病的过程
[11]。
除了血糖、血脂和胰岛素水平紊乱外，糖尿病患者往往也伴有严重的维生素 A 类物质水平失衡。早在 1937 年就有研究人员报道糖尿病患者肝中视黄醇水平显著升高，近期的临床研究和动物实验均显示糖尿病和肥胖引起体内维生素A 类物质紊乱
[12-13]。笔者所在实验室研究显示，高脂饲养大鼠和糖尿病大鼠体内维生素 A 类物质水平紊乱，胰腺、肝和肾等组织中视黄醇浓度明显增加，而血中视黄醇浓度明显降低，同时还发现高脂饲养大鼠和糖尿病大鼠肝中视黄酸浓度显著增加，而视黄醛浓度显著降低， 这种视黄醛和视黄酸浓度改变和肝脏 ADH/RDH 活性与表达降低以及 RALDH 活性与表达增加相对应 [13]。有文献报道视黄酸和 RXR 激动剂 LG268 可引起大鼠血浆中三酰甘油水平升高
[14]。另有文献报道临床病人服用视黄酸常伴随高血脂血症等副作用
[15-16]。RALDH1a1-/ -基因敲除小鼠也表现出较低的空腹血糖和肝糖异生水平，其肝和脂肪等组织中也呈现低浓度的视黄酸和高浓度的视黄醛，且高脂饲料喂养也不易引起 RALDH1a1-/ -小鼠肥胖和胰岛素抵抗发生
[17]。此外研究还发现，用维生素 A 缺乏饲料喂养大鼠 6 周后，维生素 A 缺乏大鼠血浆中葡萄糖、三酰甘油和胰岛素等指标相对于对照组大鼠有明显降低，且体内脂肪堆积减少，体质量降低
[18]。这些结果说明视黄酸浓度紊乱有可能参与糖尿病发生发展。视黄酸对糖尿病进程的影响正成为近期研究的热点，本综述将从视黄酸对糖脂代谢、胰岛素分泌以及胰岛素抵抗的影响及其调节机制等方面展开探讨。
1
外消旋化修饰简述
蛋白质是一种手性分子，其结构由其氨基酸组成和结构所决定。除甘氨酸外，天然存在的氨基酸都具有 2 种手性形式，因而可能形成具有相同氨基酸序列的非对映异构体蛋白。最初，生物学上认为生物体只利用 L-氨基酸来合成蛋白质
[1]。20 世纪40 年代起，在微生物体内发现含 D-氨基酸多肽
[2]， 其中一些多肽是通过硫酯中间体
[3]
在多酶复合物上逐步组装的。在 20 世纪 80 年代， Kreil 等
[4]
从南美树蛙的皮肤分泌物中分离出了一种具有生物活性的 D-氨基酸多肽。
蛋白质的氨基酸外消旋 化（amino acid racemization，AAR）指蛋白质中至少 1 个氨基酸残基从 L-氨基酸转变为 D-氨基酸，这是一种蛋白质翻译后修饰（post-translational modification，PTM）类型，通常用 D-/L -氨基酸含量比值表示修饰程度
[5]。AAR 可能会引起蛋白质分子内氢键、高级结构等的变化，从而导致蛋白质的活性、稳定性等物理和生化特征的改变
[6-7]。蛋白质的 AAR 修饰研究对疾病生物标志物的探寻、重大疾病发病机制的探索等均具有重要意义。
2 外消旋化修饰与疾病相关性
生物体内 AAR 修饰速率较慢
[8]。在含有代谢稳定的长寿蛋白质的各种人类和动物组织中，能够发现 AAR 修饰呈年龄依赖性。对不同年龄层次人群的椎间盘弹性蛋白（intervertebral disc，IVD) 中天冬氨酸（Asp）的 AAR 修饰进行分析
[9]，结果显示弹性蛋白中 D-Asp 与 L-Asp 比值随年龄增长呈升高趋势，并推测 IVD 中 Asp 的 AAR 修饰可能干扰弹性蛋白、胶原蛋白和蛋白聚糖分子的三级结构和功能，引发椎间盘的组成和结构发生变化，从而导致疾病的发生
[10]。人大脑神经纤维蛋白（Tau 蛋白） 的相关研究发现，Tau 蛋白重复结构域中 Asp265
发生 AAR 修饰
[11]，人大脑中 D-Asp 水平显著增加可能使维持髓鞘结构和白质正常功能的蛋白失效
[12]， 导致大脑功能障碍或阿尔茨海默病（AD）。其他如晶状体中的 α-、β -晶体蛋白
[13-14]
也存在年龄依赖性的 AAR 情况。
3
蛋白质整体外消旋化修饰的分析方法
蛋白质整体 AAR 修饰水平一般通过水解后分析 D -与 L-氨基酸的比值来评价。通常提取分离目标蛋白后，采用酸水解法将蛋白质水解成游离氨基酸，然后分析各氨基酸 D -型与 L-型的比值，从而判断蛋白质中各氨基酸 AAR 修饰水平。
常用的分析手段包括液相色谱质谱联用技术（LC-MS）、毛细管电泳色谱质谱联用技术（CE-MS）、二维液相色谱质谱联用技术（2D-LC-MS）及核磁共振（NMR）技术等。LC-MS 法通常使用手性衍生化试剂将酸水解后的 D-/L-氨基酸衍生化，得到互为非对映异构体的衍生产物，在反相柱上分离后进行质谱检测。常用的手性衍生化试剂包括 2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯（GITC）[15-16]
等，一些新型衍生化试剂如琥珀酰亚胺基 (4S)-(3-[（苄氧基）羰基 ]-5-氧代-1，3-唑烷-4-基 ) 乙酸酯 [(S) -COXA-Osu] 等
[17]
因具有质谱兼容性好、生物基质影响小等优点而被用于 AAR 修饰的分析。
CE-MS 法多数通过在电泳缓冲液中加入手性试剂从而实现 D-/L -氨基酸的分离和 AAR 修饰的测定，常用的手性选择剂包括环糊精等
[18]。同时，有文献报道可使用异硫氰酸荧光素（FITC）结合毛细管电泳/激光诱导荧光技术（CE/LIF）来对神经肽的AAR 修饰进行检测
[19]。
2D-LC-MS 法的优势在于可减小生物样本基质干扰，以叔丁基氨甲酰奎宁（tBuCQN）手性柱和奎尼丁（tBuCQD）手性柱为一维和二维的色谱柱，由于这 2 种固定相具有相似的化学选择性和相反的手性结构，对手性组分呈现反向洗脱顺序，使其在一维和二维中的洗脱位置不同，而非手性组分在一维及二维色谱中洗脱位置不变，从而从目标对映体的色谱空间中去除，避免与潜在干扰重叠
[20]。
NMR 法是通过对含有（R）-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸的样品溶液进行 1H-NMR 分析，对结果中 1 个或多个质子的光谱不等效性进行比较，有效地实现氨基酸 AAR 修饰的鉴别
[21]。
上述这些方法可用于蛋白质整体 AAR 修饰水平的鉴定和测定，但一方面受到蛋白质水解、衍生化过程中 L-氨基酸向 D-氨基酸转化的干扰，另一方面仅能对蛋白质中各氨基酸整体的 AAR 修饰情况进行鉴定，无法确定 AAR 修饰位点，更难以实现蛋白质活性中心等特定位点的AAR 修饰的分析[22]。
4 特定位点外消旋化修饰的分析方法
特定位点 AAR 修饰分析方法可确定 AAR 修饰位点，通常用于蛋白质中活性中心或功能相关肽段中的 AAR 修饰的定量检测。常用的分离分析手段包括特异性酶解 LC-MS 法、免疫分析法。
蛋白质特异性酶解 LC-MS 法是使用一些具有特异性识别位点的酶对蛋白质进行酶切，得到包含目标氨基酸的肽段，从而可对特定位点氨基酸 AAR 修饰进行定量测定。天冬氨酸 N 端内切酶（Asp-N） 仅识别 L-α-Asp 残基的 N 端，蛋白异天冬氨酰甲基转移酶（PIMT）只切割含有 L-β-Asp 的肽段
[23]，D-天冬氨酸内切酶（paenidase）[24]
只特异性识别 D-α-Asp 残基的 N 端。现已成功联合应用这 3 种特异性识别 D-/L-Asp 的商品化酶来鉴别晶状体中 Asp 的AAR 修饰情况
[25]。但此方法由于酶的特异性，可能存在无法识别酶切位点，从而产生假阴性结果，如D-天冬氨酸内切酶无法特异性消化αBT10 肽段（αB -晶体蛋白中第 93 至 103 位的氨基酸序列），推测是由于 D-天冬氨酸内切酶具有序列特异性
[25]；此外， 商品化酶的使用成本较高，不适用于大量样品的检测分析
[26]。
酶联免疫吸附测定法（ELISA）根据其抗体的序列特异性可确定 AAR 位点并进行定量测定。通过酶标记的抗原-抗体反应，通过吸光值检测可对 D -与 L-Asp 的比值进行检测，但免疫学测定法需要分析物预选，目前商品化试剂盒种类较少
[27]。
上述方法的反应条件较温和，操作中不易产生额外的 AAR 修饰，能对蛋白质活性中心或底物结合位点等功能相关位置的 AAR 修饰情况进行检测， 无需合成肽段，具有快速、低成本，以及工作量少等优点
[25]，可用于探究 AAR 修饰对蛋白质活性的影响。但这些方法大多以蛋白质特定位点或特定氨基酸为靶向，无法分析蛋白质其他位点上的 AAR 修饰情况。
4
非特定位点外消旋化修饰的分析方法
为了更全面地探究体内外 AAR 修饰的规律， 评价蛋白质功能、阐明疾病发病机制，亟需一些普适的非特定位点 AAR 修饰的分析方法，目前可应用于非特定位点 AAR 修饰测定的方法主要包括酶解 LC-MS 法、氨肽酶（aminopeptidase，APM，EC 3.4.11.2）酶解法以及离子淌度质谱法等。
5.1
酶解LC-MS 法
酶解 LC-MS 法应用于蛋白质中非特定位点氨基酸的 AAR 修饰测定，测定时主要采用胰蛋白酶（trypsin）对目标蛋白质进行酶切，对酶解后的肽段进行选择性离子监测（SIM）模式扫描分析，分析比较保留时间有差异但具有相同相对分子质量的肽段的色谱峰，同时根据理论酶切位点合成对应的D-/L -标准肽段，通过保留时间来对酶解结果进一步确证，对其进行鉴定及定量分析。
Takata 等
[28]
从人体晶状体的水溶性部分中分离出βB2 晶体蛋白，用胰蛋白酶消化 βB2 晶体蛋白后， 使用 Proteome Discover 1.0 软件中的 SEQUEST 算法进行含 Asp 肽的鉴定，然后进行 SIM，与合成得到的理论酶切片段的保留时间相比较来确认 βB2 晶体蛋白中 Asp 的 AAR 位点。结果显示，人体老化晶状体的 βB2 晶体蛋白中存在多个 AAR 位点，包括 Asp4、Asp83、Asp92 和 Asp192，同时老年人晶状体βB2 晶体蛋白中 D -与 L-Asp 的含量比值随着年龄的增长而增长。
该方法采用的酶水解不会引起额外的 AAR 修饰，能够准确定性及定量测定非特定位点 AAR 修饰情况，方法不需要大量的样品蛋白质，无需复杂的提取纯化过程，能够从所有活组织和细胞中全面寻找受损或老化蛋白质中的 AAR 修饰位点
[29]。但该方法需要合成对应的酶解肽段进行质谱保留时间的确证，合成标准肽段较耗时
[30]。
5.2
氨肽酶酶解法
APM 是一种膜结合外肽酶
[31]，可以选择性地从寡肽、酰胺和芳基酰胺衍生物 N -末端切除 L-氨基酸，主要是碱性和中性氨基酸，其中特别是对亮氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸等氨基酸具有更高的选择性和更快的水解速度
[32]，大多数L-氨基酸多肽可在 1 ~ 2 h 内被消化。而在 N -末端第2 个氨基酸位置上存在 D-氨基酸或其他蛋白质翻译后修饰的多肽对 APM 酶解具有抵抗性，这类含 D -氨基酸多肽在数天的时间内都能保持稳定不被水解， 其寿命是 L-氨基酸多肽的 10 倍以上。在研究中较常使用的APM 包括亮氨酸APM、丙氨酸APM [33]
等，APM 消化的敏感性与分子大小有关，当底物为小肽时，其酶解更快速且高效
[34]。
Ewing 等
[35]
使用 APM 酶解加利福尼亚海兔心脏神经肽，其 L-氨基酸肽段被水解，含 D-氨基酸的肽段被保留，课题组成功鉴别出心脏神经肽中具有AAR 修饰的肽段 NdWFA，通过合成标准肽段对发生 AAR 修饰的肽段进一步定量检测。该方法降低了中枢神经提取物的复杂性，不需要多肽对照品即可实现生物样本中蛋白质非特定位点 AAR 修饰鉴定。Livnat 等
[36]
也使用 APM 酶解法成功鉴别出加利福尼亚海兔神经肽中另一发生氨基酸 AAR 修饰的肽段 GdFFD，同时使用氘代盐酸对酶解后肽段进行酸水解、用 Marfey 试剂标记以及液相色谱 -质谱法来验证 D-氨基酸的存在，确定发生 AAR 修饰的氨基酸种类，并对 D-氨基酸进行定量检测。对加利福尼亚海兔腹腔神经元中另一已知含 D-氨基酸多肽的检测结果也验证了该方法的可行性，证明其对筛选潜在的含 D-氨基酸多肽有效。
APM 酶解法能够成功鉴别蛋白质中非特定位点AAR 修饰，其特殊的酶解选择性可降低生物样本检测的复杂性，但也存在一定局限性，特定的 N -末端残基会增加对 APM 酶解的抵抗力，例如，在 N -末端带有脯氨酸、谷氨酸的多肽可以抵抗 APM 消化
[35]， 使这些多肽在较长一段时间内保持稳定，呈现假阳性结果。同时，当 AAR 修饰发生在肽段中间附近， 或发生在 C -末端附近，则 APM 在酶解过程可能会忽略这个位点
[37]，从而导致假阴性结果，在这种情况下，可以对羧肽酶进行研究，看其是否具备与APM 类似的选择性酶切 D-氨基酸的特性，为更全面研究 AAR 修饰规律提供基础
[36]。
5.3
离子淌度质谱法
离子淌度质谱（ion mobility mass spectrometry， IM-MS）是离子淌度光谱与质谱联用的一种新型质谱分析技术，其灵敏度高、检测限低并具有实时检测能力
[38]。离子淌度质谱分离原理主要是基于离子的大小和形状的差异，离子受电场力作用向前运动， 但不同离子在飘移管中与缓冲气体碰撞的截面不同， 产生不同的阻力从而使其穿过漂移管所需的漂移时间存在差异
[39]。较为常用的离子淌度质谱有漂移时间离子迁移质谱（DTIMS）、行波离子迁移质谱（TWIMS）及场不对称波形离子迁移质谱（FAIMS）[40]这 3 种。目前所使用的 IM-MS 具备基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）或电喷雾离子源（ESI） 等离子源，或四级杆质谱和离子阱质谱等质量分析器串联使用，从而提高检测的分辨率和灵敏度[41]。
在对含 D-/L-氨基酸的多肽进行 IM-MS 分析时， 由于构型不同，离子穿过漂移管时有先后顺序[42]，D-/L -肽段的 b/y 系列各碎片离子的检出是 IM-MS 法鉴定外消旋化修饰位点的前提。碰撞诱导解离（CID） 技术系使母离子与高压高能惰性气体（如 He、N2 等） 发生反复碰撞，使分子积聚能量，当达到一定能量阈值，化学键发生断裂从而产生产物离子，但受肽段浓度、链长等因素的影响，其能提供的肽链信息有限
[43]，特别是肽段带有多电荷且肽链较长时序列组成较难分析，导致 IM-MS 难以鉴定 AAR 修饰位点。利用电子转移裂解（ETD）技术
[44]，将电子转移至质子化的肽段，可得到更全面的系列碎片离子并增强碎片响应（S/N），便于后续 IM-MS 测定， 其裂解方式可以提供蛋白质翻译后修饰的重要序列信息，从而大幅度提高 AAR 修饰检测的覆盖度和灵敏度，因此在蛋白质组学、复杂化合物以及 AAR 分析方面显示出特有的优势，逐渐在分析方面占据重要地位
[45-46]。
Dwivedi 等
[47]
采用漂移时间离子迁移质谱法（DTIM-MS），以(S)-(+)-2-丁醇为漂移气体改进剂， 不同离子在漂移室中经电场力作用，与漂移室中的中性气体发生碰撞，各离子因结构不同，受到的前进阻力也有差异，因此穿过漂移室的时间也各不相同，从而得以分离。该方法成功分离了包括丝氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等在内的多种物质。Yu 等
[48]
采用离子淌度迁移质谱法研究了一些常见手性氨基酸，成功分离了色氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及组氨酸，该方法对含芳香环、长链以及活性侧链的氨基酸有显著的手性分离能力，峰间分辨率高达 1.826 [49]。
Jeanne Dit Fouque 等
[50]
使用行波离子迁移质谱法（TWIM-MS），其分离室中配备多个环形电极， 相邻电极上的电压方向相反，从而形成如波浪般的电场压力，不同离子在电场中的行进速度不同，通过改变行波电场的移动速度可以很好地分离皮啡肽1-4、啡肽Ⅰ、生长激素抑制素-14、γ-黑素细胞刺激素（γ-MSH）等 D-氨基酸多肽。对于具有多电荷的大分子多肽，选择监测 [M+2H]2+ 或 [M+3H]3+ 离子能有更好的效果。我们已经证明了该方法可以检测到定量限小于 0.25% 的 AAR 多肽，比文献报道的其他 LC-MS/MS 方法更好。分解 AAR 多肽的碎裂模式可以识别具有多电荷的大分子多肽并进一步降低检测限和定量限，由于自由基驱动的 MS/MS 过程比碰撞诱导的解离提供更好的 AAR 修饰识别， TWIM-ETD/ECD-MS 技术将推动生物体中 AAR 修饰分析的发展。Jia 等
[51]
采用 TWIM-MS 法准确测定了肽段中的 D-氨基酸的 AAR 位点，并将该方法应用于高血糖激素中 D-苯丙氨酸的 AAR 检测。
离子淌度质谱法可以检测常规质谱法不能区分的复杂化合物或外消旋体等，同时与色谱分离方法相比，所需分析时间短，且该方法的样品前处理步骤少，简单易行，提高了 AAR 修饰鉴定的效率，具有其独特的优势
[52]，但 D-/L-氨基酸肽段的 IM-MS 结果差异较小，生物样品中的 AAR 修饰检测容易出现假阳性、假阴性的情况
[53]。
6 结语
随着科学技术不断发展，蛋白质中非特定位点氨基酸 AAR 的研究已愈发多样化，如何提高生物样本非特定位点 AAR 修饰检测的准确率，减少检测结果的假阳性及假阴性情况，同时提高定量分析的重现性，是非特定位点 AAR 修饰研究亟待解决的问题。建立更多高效简便的非特定位点氨基酸 AAR 位点鉴别及定量检测的评价方法，有助于更全面地研究体内外 AAR 修饰对蛋白质生理功能的影响， 也对阐明蛋白质 AAR 与重大疾病间的关系具有重要意义。
