使用三点校正法测定维生素A的含量的方法介绍
一、实验资料
1、检验药品
(1)检验药品的名称 维生素A软胶囊。
(2)检验药品的来源 市场购买或送检样品。
(3)检验药品的规格、批号、包装及数量 根据药品包装确定,并记录有关情况。
2、质量标准
检验依据:《中国药典》(2010版)二部(附录Ⅶ J)。
可用紫外-可见分光光度法[《中国药典》(2010版)附录Ⅳ A]或高效液相色谱法[《中国药典》(2010版)附录VD]测定维生素A及其制剂中维生素A的含量。以单位表示,每单位相当于全反式维生素A醋酸酯0.344μg或全反式维生素A醇0.300μg。
测定应在暗室中进行。本实验采用紫外可见分光光度法测定维生素A的含量。
二、实验过程
1、仪器、试药的准备及试液的配制
1)仪器的准备
紫外-可见分光光度计(配对石英比色皿)、电子或分析天平(感量0.1mg)、量筒、容量瓶(100mL,2个)、玻璃棒、移液管(5mL)。
2)试药试液的准备
维生素A软胶囊,环己烷。
2、检验原理
1)三点校正法的建立
维生素A具有共轭多烯醇的侧链,在325～328nm的波长范围内具有最大吸收,可用于含量测定。但是维生素A原料中常混有多种杂质,这些杂质在维生素A的最大吸收波长附近也有吸收,干扰维生素A的测定。为消除这些杂质的干扰,《中国药典》(2010版)采用三点校正法测定维生素A的含量。
2)测定原理
本法是在三个选定的波长处测得供试品吸光度,在规定条件下根据校正公式计算吸光度A校正值后,再计算维生素A的真实含量,故本法称为“三点校正法”该法原理基于两点:①在310～340nm波长范围内,杂质的无关吸收近似一条直线,且随波长的增大吸光度下降;②物质对光吸收呈加和性,即在每一波长下测得的吸光度:A样=A维生素+A杂质。
3)波长的选择
三点校正法必须选择三个波长,三点波长选择原则为一点选择在维生素A的最大吸收波长处(λ1),其他两点选择在λ1两侧(λ2和λ3)。第一法与第二法选择的这两点有所不同。
等波长差法:使λ3-λ1=λ1-λ2。《中国药典》(2010版)规定,3个波长为λ1=328nm,λ2=316nm,λ3=340nm,△λ=12nm。
等吸收比法:使Aλ2=Aλ3=6/7 Aλ1。《中国药典》(2010版)规定,3个波长为λ1=325nm,λ2=310nm,λ3=334nm。
3、检验过程
1)第一种方法
(1)测定 取供试品适量,精密称定,加环己烷溶解并定量稀释制成每毫升含9～15IU的溶液,照分光光度法,测定其吸收峰的波长,并在300nm、316nm、328nm、340nm、360nm五个波长处分别测定吸光度,计算各波长下的吸光度与328nm波长处的吸光度的比值,并分别与《中国药典》(2010版)规定的吸光度比值相减,即得到5个差值。判断每个差值是否超过规定值的±0.02,见下表。
(2)数据处理
①如果λmax在326～329nm,且A/A328比值与药典规定值的差值未超过规定值的±0.02,表示样品纯度较好,可直接按下式计算含量:
每1g供试品中含有维生素A的单位(IU)=
(328nm)×F(换算因子F=1 900)
②如果λmax在326～329nm,但A/A328比值与药典规定值的差值超过规定值的±0.02,表示杂质可能有干扰,需按校正公式计算校正值。是否需用校正值计算,则应根据不同情况而定。
A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)
若[A328(校正)-A328]/A328×100%,所得数值在±3%以内,不用校正值,仍用A328计算。
若所得数值在-15%～-3%,用A328(校正)计算;
若所得数值小于-15%或大于+3%,采用第二法测定。
③如果λmax不在326～329nm,也用第二法测定。
(3)结果计算
①计算维生素A的效价:由
计算维生素A的效价(IU/g)。公式如下:
每克供试品含维生素A的效价(IU/g)=
×1900
②计算维生素A占标示量的百分含量:由前一步骤求得的效价计算维生素A标示量的百分含量。公式如下:
2)第二种方法
(1)不能用第一种方法的样品采用第二种方法测定。
(2)测定 另精密称取供试品适量(约相当于维生素A总量500IU以上,质量不多于2g),置皂化瓶中,加乙醇30mL与50%(质量分数)氢氧化钾溶液3mL,置水浴中煮沸回流30min,冷却后,自冷凝管顶端加水10mL冲洗冷凝管内部管壁,将皂化液移至分液漏斗中(分液漏斗活塞涂以甘油淀粉润滑剂),皂化瓶用水60～100mL分数次洗涤,洗液并入分液漏斗中,用不含过氧化物的乙醚振摇提取4次,每次振摇约5min,第一次60mL,以后各次40mL,合并乙醚液,用水洗涤数次,每次约100mL。洗涤应缓缓旋动,避免乳化,直至水层遇酚酞指示液不再显红色,乙醚液用铺有脱脂棉与无水硫酸钠的滤器过滤,滤器用乙醚洗涤,洗液与乙醚液合并,置250mL量瓶中,用乙醚稀释至刻度,摇匀;精密量取适量,置蒸发皿内,微温挥发去乙醚,迅速加异丙醇溶解并定量稀释制成每1mL中含维生素A9～15IU,照紫外-可见分光光度法[《中国药典》(2010版)附录Ⅳ A],在300nm、310nm、325nm与334nm四个波长处测定吸光度,并测定吸收峰的波长。
(3)数据处理 如果λmax在323～327nm,且A300/A325比值未超过0.73,则按下式计算校正值:
A325(校正)=6.815A325-2.555A310-4.260A334
如果校正吸光度在未校正吸光度的97%～103%,则仍以未经校正的吸光度计算含量。
如果吸收峰的波长不在323～327nm,或300nm波长处的吸光度与325nm波长处的吸光度的比值超过0.73,则应自上述皂化后的乙醚提取液250mL中,另精密量取适量(相当于维生素A300～40IU),微温挥发去乙醚至约剩5mL,再在氮气流下吹干,立即精密加入甲醇3mL,溶解后,精密量取500μL,注入维生素D测定法[《中国药典》(2010版)附录Ⅶ K]第二法项下的净化用色谱柱系统,准确收集含有维生素A的流出液,在氮气流下吹干,而后照上述方法自“迅速加异丙醇溶解”起,依法操作并计算含量。
(4)结果计算
①计算维生素A的效价:由
计算维生素A的效价(IU/g)。公式如下:
②计算维生素A标示量的百分含量:由前一步骤求得的效价计算维生素A标示量的百分含量。公式如下:
