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多通道气液界面细胞直接暴露染毒技术-CultexRFS Compact

2020.6.03

多通道气液界面细胞直接暴露染毒技术-CultexRFS Compact，细胞气液界面的直接暴露。在过去的几十年里，大气污染表现出惊人的速度，特别是今年中国雾霾的污染。空气中颗粒物浓度的急剧增加导致了呼吸道急性或慢性疾病的影响。在传统研究中，是通过动物的吸入暴露实验，确定可吸入物质对健康的影响。到目前为止，用于探讨替代动物实验的研究方法，还比较少。

一种在气-液界面，空气与细胞直接接触的实验方法，由Cultex公司Aufderheide教授提出。细胞顶部表面直接暴露于一个恒流的大气环境中，底部有培养基供给，并有恒定温度及CO₂环境。2009年，Cultex公司提出了经典的辐射流气道设计（Radial Flow System -Cultex^® RFS)，Cultex RFS被誉为细胞体外暴露方法中最成功的技术。

2014年，Cultex公司推出第三代细胞暴露染毒系统Cultex RFS Compact，细胞气液界面的直接暴露。在RFS技术基础上，compact增加了细胞培养暴露腔室数量，共计6个cell culture inserts，并分为两组，可对其中一组（三个cell culture inserts）进行雾霾颗粒物暴露，另一组进行清洁空气暴露的对比实验，或6个腔室全部进行受试物/洁净空气的暴露实验。

系统内6腔室径向分布，保证颗粒物均匀的分布到每个腔室。电加热系统为细胞体外培养提供最佳温度条件，专门的CO₂接入单元保证细胞进行更长时间的体外暴露。系统集成到一个带有紧锁装置的支架中，保证系统的气密性。Cultex RFS Compact经过Cultex实验室对不同受试物质气溶胶的剂量反应（dose-response），及不同暴露时间对受试物质细胞毒性的剂量依赖（dose-dependent）进行实验验证，验证实验表明其具有高度的实验重复性及可靠性。

材料和方法

1、 Cultex RFS Compact

2、 6.5mm或12mm的细胞培养小室（cell culture inserts）

3、 Bronkhorst高精度MFC

4、培养基灌注系统

5、细胞株（ATCC：ccl-185）和分离的原代正常人支气管上皮细胞（NHBE）

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图 1: 两种气路分布的CULTEX® RFS Compact

左图: 三个细胞培养小室（cell culture inserts）暴露于受试气溶胶，另外三个平行暴露于洁净空气

右图: 六个细胞培养小室（cell culture inserts）全部暴露于受试气溶胶或洁净空气

颗粒物暴露实验在Cultex® RFS Compact中进行，细胞接种于12孔细胞培养小室中（well cell culture insert，COSTAR®/Corning），在气-液界面直接接触暴露颗粒物24小时。在实验过程中，细胞底部持续供给培养基，并通过电加热系统保证环境稳定在37°C。

香烟烟雾（全烟气/气相-K3r4F）和1.6%尼古丁液（电子烟）作为受试物质进行细胞暴露实验。

结果

用WST-1法测定细胞活性。对于电子香烟的细胞暴露，同时分析细胞氧化应激水平。暴露24后进行结果分析。结果与清洁空气控制组进行对比（图2和图3）。两组之间存在显著差异，而符号（星号）定义如下：

**** p < 0.0001非常显著, *** p = 0.0001 – 0.001 非常显著,

** p = 0.001 – 0.01 很显著, * p = 0.01 – 0.05 显著

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图2: 采用WST-1分析法分析香烟烟气（全烟气/气相）对A549细胞的细胞毒性作用。结果与洁净空气控制组的对比。Data are given as means + S.D. from 3 independent experiments with 3 samples each.

对比清洁空气，10支香烟主流烟气降低A549细胞的活性。随着更多数量烟气的暴露，细胞活性逐渐减小，同时全烟对细胞活性的影响更加明显，相比烟气相。暴露在清洁空气中的细胞与细胞孵化箱中细胞的活性未有明显变化。

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图3: 香烟烟雾和1.6%尼古丁液（电子烟）对NHBE暴露后的细胞毒性作用和氧化应激反应。结果与洁净空气控制组的对比。Data are given as means + S.D. from 3 independent experiments with 3 samples each.

对NHBE细胞，细胞活力和氧化应激水平的影响是相对的。暴露于电子烟液的细胞，细胞活性降低并氧化应激水平的增加。主流烟气的暴露，细胞的更低存活率和更高的氧化应激。清洁空气控制组的细胞比孵化器内培养的细胞表现出较高的氧化应激，这是由于清洁空气气流对细胞的机械剪切力刺激的结果。所以，孵化器和清洁空气控制的细胞存活率差异不显著。

结论与展望

• CULTEX® RFS Compact适用于6个 6.5 mm 或 12 mm 现有的通用细胞培养小室（COSTAR®和 Falcon®）的直接暴露。

• 每个CULTEX® RFS Compact 内可进行两组平行实验，三个培养小室（cell culture inserts）用于受试物，另外三个平行用于清洁空气或不同浓度受试物。

• 数据显示其具有良好的剂量效应和高度的实验重复性。

• 适用于气体为载体的各种受试物质，如香烟烟雾、纳米颗粒、PM2.5、PM10、VOCs、雾霾混合物、干粉颗粒物及雾化气溶胶等等。

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