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细胞体外暴露染毒技术的发展与展望

2020.5.12

一、简介：

不断进行的工业发展和新技术改进应用（例如，纳米技术），都导致了空气污染的不断增加，导致了肺部疾病在过去几十年里大大的增加。新的产品（例如，纳米粒子的喷雾剂）已经被广泛应用在电气工业，日常消费和医疗应用等等特别是喷雾或粉末形式应用的产品，对人体健康被认为是特别有害的。由于增加了有害物质的释放，如，当使用纳米喷雾剂的鞋护理，清洁剂，抗菌喷雾剂，或在塑料等产品的技术加工过程，也就明显增加肺部暴露机会。然而，对可吸入物质的毒性及基本病理机制的研究却了解甚少。自2006以来，欧盟化学品监管规定（注册，评估，授权和限制化学品，欧共体1907 / 2006），要求对现有的以及新推出的化学品进行毒性风险评估，包括鉴定其潜在的吸入毒性危害。人体内的毒理学数据是罕见的，因为人类中毒通常是偶然的，不可预测的，和不可控制的。具有相同或类似的实验标本数据是非常困难的。此外，社会道德的原因，在人体内开展肺毒性的研究也是不可行的。因此，毒理学数据通常在动物实验中产生。然而，动物模型也具有其局限性，例如种间差异。此外，立法需要考虑“3R”原则（减少，优化，和替代）及其发展，即需建立和验证可替代目前动物试验的方法。因此，一种以体外实验为基础的体外暴露染毒技术，进行肺毒理性评价研究是必须的。

二、细胞体外暴露染毒技术

1. 浸没式体外暴露染毒

各种体外培养模型已经被用来进行空气中气溶胶的急性毒性评价与研究。传统浸没式体外暴露染毒技术，是最简单有效的一种体外暴露染毒研究方法，到目前为止，仍有许多实验室正在使用。该方法首先是把细胞进行浸没式培养，然后把需要暴露的气溶胶物质需溶于培养液后到达细胞表面，通过细胞与培养液相互作用的方式进行进行染毒实验（如图1所示）。

图1 浸没式体外暴露染毒模式图

但是，对于肺内上皮细胞，这种方式有别于真实的气液界面暴露环境：1、暴露在浸没条件下进行，导致气溶胶特性存在潜在改变的可能；2、对于不溶于水的固体颗粒物，其在培养液中分布的均匀性较低；3、相比较于气体，颗粒物在液体中的运动速度降低，与细胞接触的效率降低。

2. 气液界面体外暴露染毒

由于浸没式体外暴露然染毒存在先天的缺陷，科学家们开始探索一种新的能够更加真实模拟体内生物效应的体外暴露染毒技术。早在1975年，Voisin等人提出的气液界面体外暴露染毒（ALI）的描述，这一描述为体外培养肺细胞的气液界面暴露（ALI）提供了依据。这一理论中细胞既可以通过底膜获取培养基，保证了细胞的体外存活率，又可实现与顶部与气体（含受试物质气溶胶）直接暴露。

图2 气液界面体外暴露染毒模式图

2.1 第一代气液界面细胞暴露染毒装置CULTEX：1999年，根据Voisin等人的描述和Tarkington等人关于动态暴露染毒的概念，德国汉诺威医学院毒理学教授Dr. Ulrich Mohr、Dr. Michaela Aufderheide等人，成功开发了第一代体外细胞培养与暴露的染毒的装置，即基于线性流的体外暴露染毒模块Cultex CG（如图3）

图3 CULTEX CG (线性流体外暴露染毒系统Linear Flow System)

第一代气液界面体外暴露染毒系统，主要特点是气路呈线性流分布。主要结构有上下两个模块，两模块形成紧密的封闭系统。其中下部模块为细胞培养部分，实验室细胞培养小室置于其中，小室底部具备37℃水浴及可流动的培养基供给；上部是与培养小室对应分布的线性的气体进出模块，通过在后端连接的抽气泵，在密闭腔室内实现负压，所需暴露物质不停进入密闭系统内完成暴露染毒后才从后端排出。细胞培养小室中形成良好的细胞培养环境，其中的细胞并可与顶部进来的气体进行直接接触，实现直接的气液界面暴露。

2.2 第二代气液界面细胞暴露染毒装置CULTEX RFS：

在受试物为气体时，气路设计是否为线性排列，并不重要，因为，气体的分布是均匀的。但当受试物为颗粒物气溶胶时，由于其具有复杂颗粒物粒径大小分布及物理化学性质，其线性方向运输将对其颗粒物的沉积产生非常大的影响。（1）颗粒物浓度及粒径分布在稀释系统中的稳定性收到影响；（2）在不同的细胞小室上沉积的粒子浓度及粒径将发生变化，导致在不同的细胞小室内沉积颗粒的平行性和重复性较差。显然，压缩空气的进气稀释是无法打破受试物质的层流分布，这将无法改变如上所述沉积效应的产生。

考虑到这些缺点，细胞培养小室和气溶胶入口分布需要进行根本性的改变。为了避免受试颗粒物暴露的不均匀性，Cultex推出全新概念的二代暴露染毒模块Cultex RFS（图4、图5）。

图4 CULTEX RFS外观图图5 CULTEX RFS内部气路图

在这里，气溶胶将通过一个带有喷嘴(Mohr, 2013)的中央入口统一进入，在喷嘴处气溶胶将均匀分散到三个中央辐射分布的通道内，通过该通道进入辐射分布的细胞培养室内，如此过程后，气溶胶在三个细胞小室内沉积的均一性和重复将大大提高。该实验中不同颗粒沉积后的图片和数据结果都显示了非常好的效果，三个细胞小室间颗粒沉积偏差和标准偏差都非常理想。与第一代线性流系统比较，我们发现二代辐射流暴露染毒模块损失了部分颗粒，即每个细胞小室内沉积颗粒总质量在减少。这是由于Cultex RFS模块中我们增加了大颗粒物（凝聚粒子）预分离技术，降低了大的或凝聚在一起的颗粒沉积到细胞表面的可能，即提供了颗粒物粒径分布的均一性，使实验受试物更稳定，既减小了粗颗粒对实验的影响，又进一步提高了实验重复性和稳定性。

2.3 第三代气液界面细胞暴露染毒装置CULTEX RFS COMPACT：

图6 COMPACT结构图

气液界面细胞暴露染毒发展到第二代技术CULTEX RFS，已经具有非常高的实验重复性和稳定性，但在实际应用中仍有一些问题，比如通道数量较少，只有3个暴露通道，且所有通道暴露同一气溶胶物质，缺少对照实验组。为此德国CULTEX实验室技术公司在2015年推出第三代气液界面细胞暴露染毒装置CULTEX RFS COMPACT（见图6），COMPACT继承了CULTEX RFS的辐射流设计等主要优点外，增加了细胞暴露腔室数量达6个，共分为两组，进行对比试验。同时优化减少了每个腔室细胞培养基加入量，整体采用电加热恒温系统，更灵巧便捷，易于进行室外大气试验。

这便是气液界面细胞暴露染毒技术的发展过程，在早期主要是细胞系（如A549）以及原代细胞（如巨噬细胞）被用于在急性吸入毒理学领域的剂量-反应关系的建立。随着时间的推移，体外暴露染毒系统已经变得越来越复杂，现在已经可以用于对呼吸道不同部位分化培养的3D细胞进行体外暴露染毒研究，特别是近期CULTEX推出的Insert Cup装置，可以很好的在体外建立细胞共培养模型。CULTEX复杂的体外暴露染毒系统的发展也为毒理学测试策略开辟了新的领域。除了在急性吸入毒理学领域已经形成稳定的验证方法外，多次重复体外暴露染毒概念，特别是无毒剂量实验已经在亚急性试验领域得到开展。

目前，体外暴露染毒技术的主要兴趣是：在体外更真实的模拟人类体内的生物效应，开展各种指定实验物质的体外暴露染毒实验。

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