光谱染色体核型分析
实验材料 AppliedSpectralImaging ( MigdalHaemekIsrael) 试剂盒组织样本
试剂、试剂盒 组织培养基秋水仙胺柠檬酸盐KCl甲醇冰乙醇去离子甲酰胺20 X SCCHClPBS MgCl2分装标记探针二甲苯
仪器、耗材 解剖刀和刀片 无菌培养皿组织培养瓶培养箱水浴锅离心管移液枪染色缸荧光显微镜
实验步骤
一、探针
已经标记好的商品探针以混合形式溶解在杂交液中。
二、从组织中制备染色体
1.在组织培养用的超净工作台中进行无菌操作，在无菌培养皿中，用刀片将组织切碎成细小的块。
2.将细碎的组织块转入有足够培养基的、具有通气孔的组织培养瓶中；培养基要盖过平面放置的培养瓶底（通常 10~15 mL)。
3.将培养瓶放入 CO2 培养箱中，静置培养 24 h。
4.光镜下观察其生长状态。
5.当达到要求的生长状态或培养时间时，向培养瓶中加入秋水仙胺至终浓度 l(ug/mL，在 CO2 培养箱中继续培养 2~3 h(见注释 1)。
6.将培养基和悬浮的组织或细胞一起转移到 15 mL 锥形底离心管（见注释 2)。对于非贴壁细胞，继续步骤 10。
7.向培养瓶中加入 IOmL 柠檬酸盐溶液，漂洗贴壁的细胞，弃去柠檬酸盐溶液。
8.向培养瓶中加入 10mL 1 X 胰酶。观察贴壁细胞自培养瓶壁上脱离，轻轻吹打，将细胞自瓶壁上吹打下来，转移到 15 mL 锥形离心管中。
9.向含有贴壁细胞的 15 mL 锥形离心管内加入 5 mL 新鲜配置的培基（见注释 3)。
10.1500 g 离心 10min 收集细胞。
11.倒掉或吸出上清，只留下 0.5~1mL 溶液。用手指轻轻敲打管底，打散细胞团。
12.加人预热的 0.075mol/L KCl 溶液，开始的 1mL 逐滴加入，滴加中间混匀（见注释 4); 然后将剩下的 14mL 加入并轻轻颠倒混匀，37°C 放置 10min。
13.加入 5 滴比例为 3:1 的甲醇：冰乙酸，混匀（见注释 5)。
14.1500g 离心 10min。
15.倒掉或吸出上清，打散细胞团（见注释 6)。加入新鲜配置的甲醇：冰乙酸（3:1) 固定液 15 mL，用上述的方法开始的 ImL 逐滴加入，滴加中间混匀；然后加入剩余的 14 mL 固定液，并轻轻颠倒混勻。
16.1500 g，离心.10min。
17.重复步骤 15 的固定。然而，最初的 1mL 不需要逐滴加人。离心，重复固定 3 次。
18.细胞悬液可以以固定液中细胞团的状态 -20°C 保存。
19.为了进行染色体标本制备，倒掉固定液，重悬细胞团块，加入适量的新鲜固定液使悬液轻度浑浊。
20.用 200ul 的枪，吸取 100ul 悬液，滴到干净的载玻片上（见注释 7)，室温下晾干并储存片子。滴好的片子至少自然老化 2d 或 37°C 过夜老化。
三、染色体标本预处理和变性
1.染色体标本至少自然老化 2d 或用前 37°C 过夜。
2.染色体标本在系列乙醇（70%、80% 和 95%) 中分别脱水 5 min，晾干。
3.加入 15~20uL 的 10% 胃蛋白酶储存液（见注释 8) 到 50 mL 预热的 O.Olmol/L HCl 中，将染色体标本在 37°C 染色缸中温育 5 min(见注释 9)。同时，准备一缸 70% 甲酰胺/2 X SSC 溶液并放入 75°C 水浴中预热。
4.取出标本，在室温下的 1 X PBS 中漂洗 5 min。
5.在 1 X PBS/MgCl2 室温温育 5 min。
6.向 50 mL l X PBS/MgCl2 中加入 1.5 mL37% 甲醛，在室温下的该溶液中温育标本 10min(见注释 11)。
7.在室温中的 1 X PBS 中漂洗 5 min。
8.按步骤 2 中所述方法再次进行系列乙醇脱水。
9.晾干片子后，检查甲酰胺溶液的温度是否达到 75°C(见注释 11); 将染色体标本在 75°C 甲酰胺溶液中变性 2 min。
10.迅速将标本转移到冰冷的 70% 乙醇中并用系列乙醇脱水（见注释 12) 后晾干。
四、探针变性
1.对于每张标本，22 mm X 22 mm 盖玻片的范围内需要用 10uL 探针；如果该区域大于此范围，增加探针的使用量。取适量的探针到一个 Eppendorf 管中。
2.在水浴锅或 PCR 仪上 75°C 热变性探针 10min。
3.将探针于 37°C 水浴中预复性 lh。
五、杂交
1.从 37°C 中取出预复性的探针，小心的加到变性的中期染色体标本上。因为探针既有直接标记又有间接标记，应迅速操作并避免长时间暴露在光线条件下。
2.小心的盖上盖玻片，注意不要产生气泡。如果出现气泡，轻按盖玻片，将气泡挤出。
3.用橡皮泥封好盖玻片边缘。
4.放入杂交盒（见注释 13)，并放入塑料袋中（可选择的），在 37°C 条件下杂交 48 h。
六、杂交后洗脱和检测
1.在 45°C 水浴中预热所有的溶液。
2.从杂交盒中取出片子，小心除去橡皮泥。盖玻片也许随橡皮泥一块揭去或仍留在片子上。如果盖玻片留在片子上，直接将标本放入第一缸洗脱液。
3.在 50% 甲酰胺/2 X SSC 中洗 3 次，每次 5 min。在第一次洗脱时盖玻片应滑掉。轻轻振荡染色缸几秒钟（见注释 14)。
4.在 1 X SSC 中洗片 3 次，每次 5 min 并轻轻振荡。
5.标本浸在 0.01%Tween-20/4 X SSC 中，取出标本，甩掉多余的液体，但保持片子表面湿润。
6.取 30~40uL SKY 试剂盒（Applied Spectral Imaging 提供）的瓶 2 中的封闭液加到标本上，盖上盖玻片。
7.将标本放回杂交盒，37°C 温育 30 min。
8.小心移开盖玻片，取 30~40pLSKY 试剂盒（Applied Spectral Imaging 提供）的瓶 3 中的检测溶液加到片子上，并盖上盖玻片。
9.将标本放回杂交盒，37°C 温育约 30 minD
10.小心移开盖玻片，在 0.01%Tween-20/4XSSC 中洗 3 次，每次 5 min。轻轻振荡。
11.甩掉多余的液体，取 30~40ul SKY 试剂盒（Applied Spectral Imaging 提供）的瓶 4 中的检测溶液加到标本上，盖上盖玻片。
12.将标本放回杂交盒，37°C 温育 30 min。
13.小心移开盖玻片，在 0.01%Tween-20/4XSSC 中洗片 3 次，每次 5 min。轻轻振荡。
14.在室温下的 2XSSC 中漂洗片子。
15.用 15~20 斗瓶 5 中的 DAPI/抗淬灭剂封片，盖上盖玻片，避免产生气泡。
16.可以进行阅片。标本应在一 20°C 保存。
七、图像抓取
1.尽可能及时的进行图像抓取和分析。尽管荧光素在一 20°C 并尽可能少的光线条件下能保存几个月，但随着时间的延长，信号强度会减弱（见注释 17~20)。
2.在实验室安装系统时进行用该系统抓取图像和分析的培训。
八、用 SKY 探针与曾 G 显带过的中期染色体标本的杂交：标本预处理
1.在室温下的二甲苯中洗 2 次，每次 5 min，除去 G 带标本上残留的镜油 (见注释 15)。
2.将标本浸在甲醇中 10~15 min 褪色，或直到标本完全褪色。
3.标本褪色后，进行系列乙醇再水合：95%、80% 和 70% 乙醇，每次 5 min，瞭干。
4.继续从本章 3.3 的步骤 5 开始。
5.如果标本曾显带过，在 70% 甲酰胺/2 X SSC 中变性时间需调整以反映标本特性（见注释 16 和表 1)。保守变性时间为 40s。
